线粒体内膜和外膜之间的间隙，约6～8nm, 其中充满无定形的液体，含有可溶性的酶、底物和辅助因子。膜间隙的标志酶是 腺苷酸激酶 。
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线粒体 膜间隙 （ 英语 ：Intermembrane space of mitochondria）也称为“ 线粒体膜间间隙 ”，是线粒体外膜与线粒体内膜之间的空隙，宽约6-8nm，其中充满无定形液体。由于线粒体外膜含有孔蛋白，通透性较高，而线粒体内膜通透性较低，所以线粒体膜间隙内容物的组成与 细胞质 基质十分接近，含有众多生化反应底物、可溶性的酶和辅助因子等。由于 蛋白质 不能穿过孔蛋白，所以它们必须以一段特定的信号序列以供识别并转运进膜间隙，细胞色素 c 正是以这种方式进入膜间隙的。线粒体膜间隙中还含有比细胞质基质中浓度更高的腺 酸激酶、单磷酸激酶和二磷酸激酶等激酶，其中 腺苷酸激酶 是线粒体膜间隙的标志酶，它可以 催化 膜间隙中三磷酸腺苷（ adenosine triphosphate，简称“ atp ”）分子末端的磷酸基团转移到 单磷酸腺苷 （adenosine monophosphate，简称“ AMP ”）分子上，生成两分子的 二磷酸腺苷 （adenosine diphosphate，简称“ ADP ”）。
线粒体膜间隙中存在的 蛋白质 称为“线粒体膜间隙蛋白质”，这些蛋白质全部在 细胞质 基质中合成。有研究指出，线粒体膜间隙蛋白质在诱导癌细胞凋亡中具有重要作用。
转运机制
在细胞质基质中合成的蛋白质进入线粒体膜间隙需要两段导向序列：位于蛋白质N端的基质导向序列（marix-targeting sequence）和紧接其后的膜间隙导向序列（intermembrane-space-targeting sequence）。拥有这两段导向序列的 蛋白质 能以保守性寻靶（conservative targeting）或非保守性寻靶（nonconservative targeting）这两种转运方式进入线粒体膜间隙。