冷冻电镜

冷冻电镜（Cryogenic-electron microscopy，Cryo-EM）是用于扫描电镜的超低温冷冻制样及传输技术。可实现直接观察液体、半液体及对电子束敏感的样品，如生物、高分子材料等。

1931年，德国物理学家马克斯·诺尔（Max Knoll）和他的学生恩斯特·鲁斯卡（Ernst Ruska）发明了第一台透射电子显微镜，并于1933年首次突破了光学显微镜的极限。 1974年，加利福尼亚大学伯克利分校的Robert Glaeser和他学生Ken Taylor 首次提出冷冻电镜。 1982年，雅克•迪波什开发出真正成熟可用的快速投入冷冻制样技术制作不形成冰晶体的玻璃态冰包埋样品。1984年，雅克•迪波什首次发布不同病毒的结构图像。1990年，理查德•亨德森成功利用电子显微镜在原子分辨率上生成了蛋白质的三维图像。 2013年之后，冷冻电镜分辨率提高到接近原子水平。 2016年报道了冷冻电镜得到的谷氨酸脱氢酶的3D结构（334 kDa），分辨率甚至达到1.8Å。清华大学隋森芳教授的光和反应实验中，有一个捕获光能的蛋白质复合体的重要结构被解析出来。2018年，中国科学技术大学教授毕国强、刘北明与加州大学洛杉矶分校教授周正洪组成课题组，利用冷冻电镜技术对完整突触进行了系统性定量分析。美国神经科学学会会刊《神经科学》以封面形式对此进行了报道。 2019年，中国科学家利用冷冻电镜技术解析到世界上分辨率最高的猪瘟病毒结构。

冷冻电镜的基本原理是将样品经过超低温冷冻、断裂、镀膜制样（喷金/喷碳）等处理后，通过冷冻传输系统放入电镜内的冷台（温度可至-185℃）即可进行观察。其中，快速冷冻技术可使水在低温状态下呈玻璃态，减少冰晶的产生，从而不影响样品本身结构，冷冻传输系统保证在低温状态下对样品进行电镜观察。对冷冻并固定在玻璃冰中的生物大分子进行成像，从而获得蛋白质分子在各个方向上的投影。然后使用计算机处理和计算大量的2D（二维）图像，并重建生物大分子的3D（三维）结构。

冷冻电镜技术在生物学、材料科学等多个领域已经成为重要的研究工具。它通过超低温冷冻和低剂量成像技术，有效地克服了传统电子显微镜在观察生物大分子和其他辐射敏感材料时的局限性。 2015年，《自然》旗下子刊Nature Methods将冷冻电镜技术评为年度最受关注的技术。2017年度的诺贝尔化学奖授予雅克·迪波什（Jacques Dubochet）、约阿基姆·弗兰克（Joachim Frank）和理查德·亨德森（Richard Henderson），表彰他们在开发用于溶液中生物分子高分辨率结构测定的冷冻电镜技术。

历史沿革

几十年来，电子显微镜一直是研究生物大分子结构的重要工具。随着低温和速冻技术的发展，冷冻电镜技术应运而生，允许科学家在低温下观察样品，以减少辐射损伤并保持生物大分子的自然状态。

早期发展

1931年，德国物理学家马克斯·诺尔（Max Knoll）和他的学生恩斯特·鲁斯卡（Ernst Ruska）发明了第一台透射电子显微镜，并于1933年首次突破了光学显微镜的极限，使得看到更小的粒子成为可能。电子显微镜成像需要在高真空下进行，电子对生物样品的辐射损伤非常大。因此，在接下来的几十年里，科学家们只能通过重金属盐染色来对生物样本进行成像。

1968年，在剑桥大学 MRC 分子生物学实验室里，阿隆·克鲁格（Aron Klug）和他的学生德·罗西尔（De Rosier）在Nature上发表了一篇关于利用电子显微镜照片重构噬菌体病毒尾部三维结构的论文，提出并建立了电子显微三维重构的一般概念和方法。阿隆·克鲁格因此获得1982年诺贝尔化学奖。1974年，加利福尼亚大学伯克利分校的罗伯特·格莱瑟（Robert Glaeser）和他学生肯·泰勒（Ken Taylor）首次提出冷冻电镜，并测试了冷冻含水生物样品的电镜成像，目的在于降低高能电子对分子结构的损伤，并因此实现高分辨成像。

1975年，冷冻电镜应用在“死”物质里如火如荼，但由于生物样品的复杂性和结构的多样性，强电子束、真空腔，这些环境使得生物样品注定被破坏，使得冷冻电镜在生物学领域被普遍认为“不适用”。然而，亨德森在菌紫红质（bR，能吸收光能）上的尝试，证明了电子显微镜在生物领域的适用性。之后，在阿隆·克鲁格等人提出的三维重构技术的基础上，亨德森和同事获得了细菌视紫红质较为粗糙的三维立体结构图像。这也是历史上第一张膜蛋白领域的三维结构。同年，阿希姆·弗兰克（Joachim Frank）开始思考如何对电子显微镜获得的二维平面模糊图像进行分析和叠加处理，最终得到更高分辨率的三维立体图像。

技术演进

1978年，雅克·迪波什（Jacques Dubochet）开始解决电子显微镜领域的样品干涸并遭破坏的问题。迪波什得出的方法是对生物样品进行玻璃化（vitrifying H₂O ）。一般情况下，通过氢键的相互作用，水分子会在凝固过程中形成有序排列，形成晶体。而迪波什想到的即是在水分子相互作用之前就让其凝固，将生物样品浸入事先经液氮冷却的乙烷中，就能使水迅速冷却、在数毫秒之内完全凝固，这种方式得到的就不是晶体而是无定形态，而玻璃也是处于无定形态，玻璃化名称由此而来。生物样品嵌在无定形冰中，堪称留下了真实的一瞬间。

1981年，雅克·迪波什（Jacques Dubochet）和他的同事阿拉斯代尔·麦克道尔（Alasdair McDowall）在电子显微镜技术上取得了突破。他们介绍了快速冷冻的方法，它迅速将分子冻结在单层玻璃态水中，解决了高真空和辐射损伤的问题。同年，弗兰克完成了一种算法，利用计算机识别图像把相同蛋白质的不同影子收集起来，并且将轮廓相似的图像进行分类对比，通过分析不同的重复模式将图片拟合成更加清晰的2D图像。在此基础上，通过数学方法，在同一种蛋白质的不同2D图像之间建立联系，以此为基础拟合出3D结构图像。阿希姆·弗兰克的图形拟合程序被认为是冷冻电镜发展的基础。

1982年，雅克·迪波什开发出真正成熟可用的快速投入冷冻制样技术制作不形成冰晶体的玻璃态冰包埋样品。1984年，雅克·迪波什首次发布不同病毒的结构图像。至此，相对容易地使用电子显微镜观察生物大分子的要素基本集齐。1990年，亨德森再次对外发布了分辨率达到原子层面的菌紫红质立体图像，这一突破性成果有力证明了用电子显微镜进行生物分子成像的潜力。要实现原子分辨率，仍面临许多挑战。例如，电子显微镜图像中的对比度和信噪比较低。此外，还需要将2D图像转换为3D结构。约阿基姆·弗兰克（Joachim Frank）和他的同事马林·范·海尔（Marin van Heel）率先使用计算图像处理技术，计算和平均生物大分子的多个图像副本，以提高信噪比。在获得不同角度的2D图像后，通过计算机软件进行3D重建，以分析生物分子的3D结构。到1999年，大肠杆菌核糖体50S大亚基的分辨率已提高到7.5Å。之后，直接电子探测器的引入极大地提高了成像的信噪比和数据采集速度，为冷冻电镜技术的进一步发展奠定了基础。

后续发展

在2000年后，电子显微镜结构的数量开始逐年增加，但分辨率并不高。 2005年前后，冷冻电镜技术解析的结构分辨率还较低，当时能做到的最好分辨率是利用高对称病毒颗粒求解的7.4Å，如果是大一点的配位化合物，譬如核糖体，则只能做到11.5Å左右。当时电镜照片的记录载体是胶片或CCD（charged coupled device）。胶片比实时方便的CCD拥有更好的探测效率（detective quantumefficiency，简称DQE），但非常费时。人们迫切需要一个全新的、能高效率探测到电子（提升信噪比）同时还能方便快速实时的相机。来自加利福尼亚大学-圣地亚哥分校（UCSD）、伯克利国家实验室（LBNL）和加利福尼亚大学尔湾分校（UCD）的联合小组，以及剑桥大学 MRC实验室法鲁吉（Farugi）和亨德森（Henderson）领导的小组都将目光转向了直接电子探测器，并分别独立发表了他们的工作。后来UCSD和UCI的小组开发了DE（direct electron）相机，MRC小组和 FEI公司合作开发了Falcon相机，LBNL小组以及加州大学旧金山分校（UCSF）的大卫·阿加德（David Agard）教授则帮助Gatan公司开发了K2相机。2012年到2013年前后，这些直接电子探测器相机开始大范围应用到冷冻电镜领域中。相比较传统光电耦合的 CCD相机，直接电子探测器可以精准地计算出电子的位置来显著地提高电镜的图像质量，而且能用类似电影的方式快速记录电镜图像，从而帮助我们追踪并矫正样品漂移轨迹，同时还可以矫正辐射损伤。这些优势都将冷冻电镜的图像质量提高到了一个全新的台阶，使冷冻电镜的分辨率因此得到了极大的提高，并达到可以和X射线相媲美的程度。而且，冷冻电镜技术不需要结晶，对样品的质量和使用量也远没有晶体学需求的那么高，并且能利用三维分类等方法一次解出多种状态的结构，引起了研究者的极大关注，因此，许多传统晶体学研究组也开始转向并大量应用冷冻电镜技术。

2013年，加州大学旧金山分校（陈晓薇）程亦凡和大卫·朱利叶斯（David Julius）的研究组用冷冻电镜首次得到膜蛋白TRPV1 的3.4埃接近原子级别高分辨率三维结构，这一结果被视为具有里程碑意义。从这一年开始，冷通过电子显微镜分析的结构数量开始迅速提高，分辨率也提高到接近原子水平。在中国国内，冷冻电镜方面的领军人物是中国科学院院士、结构生物学家、清华大学副校长施一公，其关于剪切复合体的研究基本都利用了冷冻电镜技术。 2015年报道的β 半乳糖苷酶的结构分辨率为2.2Å。此外，20S蛋白酶体的分辨率和70S-EF-Tu复合体分别为2.8Å和2.9Å。 2016年报道了冷冻电镜得到的谷氨酸脱氢酶的3D结构（334 kDa），分辨率甚至达到1.8Å。 2018年，已有一些文章发表冷冻电镜观察的蛋白结构，分辨率均小于2Å。

诺贝尔奖认可

2017年，诺贝尔化学奖授予了三位生物物理学家雅克·迪波什、约阿基姆·弗兰克和理查德·亨德森，以表彰他们对冷冻电镜发展的开创性贡献。

工作原理

冷冻电镜技术的基本原理是将生物大分子溶液置于电镜载网上形成一层非常薄的水膜，然后利用快速冷冻技术将其瞬间冷冻至液氮温度下。冷冻速度非常快，以至于水膜无法形成晶体，而是形成一层玻璃态的冰。生物大分子就被固定在这层薄冰里。将这样的冷冻样品保持低温放置在透射电子显微镜下观察，从而获得生物大分子的结构，被称为冷冻电镜技术。

在透射电子显微镜下，高能电子束穿透每一个分子，如同X光穿过人的身体一样，可以拍摄到分子的形貌和它内部的结构信息。科学家们利用计算机将样本里的每一个分子提取出来，把相似的分子予以归类，然后叠加、平均获得其内部结构更为精细的图像，由此得到分子不同方向的二维结构，最后经过计算机三维重构算法，可以得到分子的三维模型。这一过程被称为冷冻电镜三维重构解析。

如通过冷冻电镜观察悬浮脂质囊泡的薄水膜时，冷冻电镜提供了薄层玻璃化样品的图像。由于玻璃化样品对电子束相对透明，因此可以获得悬浮在玻璃化基质中的物体的“透视图”。通过使用物理固定（快速冷却）作为冷冻电镜唯一的固定方法，样品保持化学未改性，从而提供悬浮材料的“真实视图”。

用于透射电子冷冻显微镜的样品通常通过将薄的水溶液膜迅速浸入液体冷却剂中进行制备。为了确保样品被埋入非晶态冰中而非晶态冰中，这些样品的冷却速率必须达到约10^4 K/s或更高。然而，由于如果与液氮（LN）接触，烷烃会完全冻结；而如果将其与液氮隔离，烷烃的温度会升高，可能导致冷却速率、最终温度或两者都不足以产生非晶态冰，因此会出现困难。为了解决这一问题，通常需要重复冷却或加热步骤以确保适当的冻结条件。通常，乙烷（Et）或丙烷（Pr）会被冷却，直到一小部分烷烃固化。样品会冻结到固体数量增加到碰撞可能会造成样品损坏为止，然后将冷却气体吹到固体上以融化它，之后可以继续冻结更多样品，并根据需要重复这一过程。

基本分类

冷冻电镜技术的基本分类包括传统冷冻电镜、高压冷冻电镜、Cryo-FIB电镜等。这些技术根据其应用和原理的不同，可以进一步细分为冷冻透射电镜、冷冻扫描电镜和冷冻蚀刻电镜三种类型。

1、冷冻透射电镜（Cryo-TEM）：这项技术通过在普通透射电镜上加装样品冷冻装置，将样品冷却到液氮温度（77K），特别适用于观察对温度敏感的样品，如蛋白质和生物切片。冷冻透射电镜（Cryo-TEM）通过冷冻降低电子束对样品的损伤，减小样品形变，从而获得更真实的样品形貌。它具备高加速电压、优良的电子光学性能、稳定的样品台和全自动操作等优点。

2、冷冻扫描电镜（Cryo- sem ）：这项技术在普通扫描电镜上加装低温冷冻传输系统和冷冻样品台装置，基于扫描电镜技术发展而来。冷冻扫描电镜（Cryo-SEM）允许直接观察液体、半液体样品，无需干燥处理，极大地减少了干燥过程对含水样品的影响。其原理是使水在低温下呈玻璃态，减少冰晶产生，获得适合观察的样品。该技术具有防止样品水分丢失、快速制样和样品可重复使用等优点。

3、冷冻蚀刻电镜（Freezeetching）：一种结合断裂和复型的制备透射电镜样品技术，能够展示细胞和组织微细结构的立体构像。通过将样品在干冰或液氮中冰冻，然后用冷刀劈开，真空中升温至-100℃使断裂面冰升华，暴露断面结构，最终获得可观察的复膜。冷冻蚀刻电镜具有使微细结构接近活体状态、观察不同劈裂面的微细结构、强立体感和耐受电子束轰击及长期保存等优点。

方法

通过冷冻电子显微镜和三维重建的结合，在结构生物学领域取得了一系列重要突破。冷冻电镜关键技术的突破主要来自于硬件和软件的发展。硬件包括电子显微镜和图像记录装置，软件包括3D重建算法和图像数据处理。

样品制备

样品制备的正确性是冷冻电镜获得可靠分析结果的重要前提，因为它决定了成像和分析样品的质量。首先，微栅上的颗粒应分散、随机取向、薄且无污染。每个制样步骤都可能对抽样质量产生重大影响，如pH值、缓冲溶液等因素。对于生物大分子，通常采用印迹法和冷冻玻璃化法制备样品，这种方法能很好地保留样品的原始结构，通过快速玻璃化将伪影降到最低，并且在操作得当时能提供一致的结果。该方法非常适合液态样品或能均匀分散到液体中的样品。然而，实现最佳玻璃化厚度是一项挑战，样品厚度的变化可能会影响所获图像的质量。处理较大或较厚的样品时，该方法也会遇到困难，因为要在整个微栅上形成玻璃状薄冰层会受到限制。如果感兴趣的样品较大、埋在大块中或要求特定的取向，则建议使用聚焦离子束（FIB）。为减少铣削过程中的束流损伤，可以考虑采用低温处理。尽管这种方法有效，但即使在低温条件下也难以避免光束损伤。此外，它还具有成本高、耗时长和整体复杂性高等特点。另一种方法是在微栅上手动分散样品，或通过原位生长，如在微栅上电化学镀锂（Li）/ 钠（Na）金属。如果样品对空气敏感，则需要专门设计的支架或容器来处理和转移样品，以免暴露在空气中。这些方法的选择取决于实施的难易程度、可重复性和具体要求等因素，因此需要根据样品的性质和冷冻电镜的预期结果做出明智的选择。

数据分析

冷冻电镜在成像上拥有更高的分辨率，已经获得了一系列新的、有吸引力的近原子分辨率结构，充分证明了这一点。例如，病原体核糖体和药物分子的复杂结构，线粒体核糖体的大亚基结构，哺乳动物核糖体配位化合物的结构，以及TRPV1离子通道的结构。冷冻电镜采用新型直接电子探测器，比传统介质（ CCD相机或摄影胶片）更灵敏、更快速，可以以每秒多帧的速率记录图像数据，而不是单次长时间曝光。直接电子检测相机不仅在检测量子效率上有了显著的提高，而且具有高帧率，使图像能够作为由堆叠帧构成的“电影”进行采集。未来，对更高分辨率的渴望必将在许多方面推动电子显微镜的发展：更薄的探测器芯片和更快的读出率，从而大大提高分辨率的信噪比；改进样品制备方法，使用在电子轰击下不易移动的支架；开发新的图像记录程序，以减少由光束引起的样品移动。此外，冷冻电镜中如Titan Krios，300kV场发射低温透射电子显微镜，配备场发射电子枪和三级聚光镜系统，可在一定照明范围内实现平行照明，拥有恒功率模式磁性镜头系统，确保成像高稳定性的，其点分辨率可达0.25nm，信息分辨率极限可达0.14nm。

数据处理

广泛使用的电镜分析软件系统主要包括SPIDER（蛛网），EMAN2（电子显微镜分析网络2），FRE ALIGN（自由对齐），SPARX（星光），RELION（重力离子）等。低信噪比或图像对比度差是冷冻电子镜的主要挑战，由于生物样品对辐射敏感，因此很难避免。它只能通过减少电子剂量来改善，这反过来又导致非常低的信噪比。新型直接电子探测器的发展和应用，极大地推动了图像处理和算法的发展。为了从嘈杂的图像中提取有价值的结构信息，研究人员开发了一种基于未确定结构的最大可能和先验信息的组装体。这款新软件在很大程度上可以在没有用户干预的情况下运行，并提供客观的分辨率标准，迅速成为冷冻电子显微镜的“黄金标准”。新的标准化验证程序使结果（包括颗粒取向、绝对手性和对比度损失）更加可靠，并且可以避免过度拟合噪声，以生成更清晰的图像。强大的分类方法可以分离出不同的分子或同一分子在同一视野中的不同结构状态。因此，新算法的发展和进步使人们对样品处理有了新的认识：样品在计算机中纯化，而不是通过艰巨、耗时且往往具有破坏性的生化过程。

应用领域

生物学

冷冻电镜在生物学研究中扮演着关键角色，其应用涵盖了多个重要领域。它能够高分辨率地解析剪接体和染色体等基因表达和调控相关配位化合物的结构，揭示了这些复合物在mRNA 加工中的作用机制。冷冻电镜还用于研究蛋白质合成和降解相关的核糖体和蛋白酶体，帮助了解它们在蛋白质合成和降解过程中的功能。对于膜蛋白，由于其在药物靶点中的重要性且难以通过传统X射线晶体学解析，冷冻电镜提供了关键的结构信息。同时，它也用于解析病毒颗粒及其相关蛋白质复合物的结构，从而有助于理解病毒的自组装和感染机制，并为药物设计提供结构基础。在神经退行性疾病方面，冷冻电镜能够揭示相关蛋白质的结构，例如ATP酶四聚体，为治疗这些疾病提供了结构基础。它还对先天免疫系统中的蛋白质，如炎症小体和TCR-CD3 复合物，提供了重要的结构信息，有助于理解免疫反应及其相关疾病的机制。

材料科学

冷冻电镜在材料科学中的应用涵盖了锂电池材料、聚合物以及金属有机骨架（MOF）。对于锂离子电池，冷冻电镜能够研究正极、负极、电解质等组件之间的界面及其纳米结构变化。聚合物领域中，冷冻电镜提供了一种避免传统电镜破坏的表征方法，能够分析无机化合物纳米颗粒对固体聚合物电解质的影响，并揭示聚合物与无机填料界面的元素分布。在金属有机骨架（MOF）的研究中，冷冻电镜用于观察MOF颗粒的晶体结构及其亚稳态结构，分析晶体缺陷对气体存储和传输的影响，以及客体分子对MOF骨架的相互作用，这些研究为理解和应用MOF材料提供了重要的信息。