凝胶电泳

分离不同物理性质分子的技术

凝胶电泳( 英语 :Gel electrophoresis)或称胶体电泳,是一大类技术,被科学工作者用于分离不同 物理性质 (如大小、形状、等电点等)的分子。凝胶电泳通常用于分析用途,但也可以作为制备技术,在采用某些方法(如质谱(MS)、 聚合酶链式反应 (PCR)、克隆技术、 脱氧核糖核酸 测序或者免疫印迹)检测之前部分提纯分子。可分为 琼脂糖 和聚丙烯 胺凝胶电泳、脉冲 电场 凝胶电泳。 蛋白质 的凝胶 电泳 通常在加入 k12 的 聚丙烯酰胺 凝胶中进行( SDS- PAGE),或者非变性凝胶电泳,或二维电泳。

基本原理

凝胶电泳的原理比较简单。当一种分子被放置 在电 场当 中时,它们 就会 以一定 的速 度移向适当的电极,这种电泳分子在电场作用下的迁移速度,叫做电泳的迁移率。它同电场的强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比。也就是说,电场强度越大、电泳分子所携带的净电荷数量越多,其迁移的速度也就越快,反之则较慢。由于在 电泳 中使用了一种无反应活性的稳定的支持介质,如 琼脂糖 凝胶和聚丙 烯酰胺 胶等,从而降低了对流运动,故 电泳 的迁移率又是同分子的摩擦系数成反比的。已知摩 擦系数 是分 子的大 小、 极性 及介质 粘度 的函数,因此根据分子大小的不同、构成或形状的差异,以及所带的净电荷的多少,便可以通过电泳将 蛋白质 或 核酸 分子 混合物 中的各种成分彼此分离开来。在生理条件下,核酸分子的糖- 磷 酸骨架中的磷酸基团呈离子状态。从这种意义上讲,D N A 和 R N A 多核苷酸 链可叫做 多聚 阴离 子 ( P ol yani o n s )。因 此,当核 酸分 子 被放 置在 电场 中时,它们就会向正电极的 方向迁 移。由 于糖- 磷酸 骨架 结构 上的重 复性 质,相同 数量 的双链 D N A 几乎具有等量的净电荷,因而 它们 能以 同样 的速 度向 正电 极 方向 迁移。在一 定的电场强度下,D N A 分子的这种迁移速度,亦即 电泳 的迁移率,取决于 核酸 分子本身的大 小和构型,分子量较小的 D N A 分子比分子量较大的 D N A 分子迁移要快些。这就是应用凝胶电泳技术分离 D N A 片段的基本原理。

决定因素

琼脂糖 主要在 脱氧核糖核酸 制备电泳中作为一种固体支持基质,其密度取决于琼脂糖的浓度。在 电场 中,在中性pH值下带负电荷的DNA向阳极迁移,其迁移 速率 由下列多种因素决定:

DNA的分子大小

线状 双链DNA 分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与 DNA分子 量 对数 成反比,分子越大则所受阻力越大,也越难于在凝胶孔隙中蠕行,因而迁移得越慢。

琼脂糖浓度

一个给定大小的线状DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。 DNA 电泳 迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。凝胶浓度的选择取决于 脱氧核糖核酸 分子的大小。分离小于0.5kb的DNA片段所需胶浓度是1.2-1.5%,分离大于10kb的 DNA分子 所需胶浓度为0.3-0.7%,DNA片段大小间于两者之间则所需胶浓度为0.8-1.0%。

DNA分子的构象

DNA分子处于不同构象时,它在 电场 中国移动通信集团 距离不仅和分子量有关,还和它本身构象有关。相同分子量的线状、开环和超螺旋 DNA 在 琼脂糖 凝胶中移动速度是不一样的,超螺旋DNA移动最快,而开环 双链DNA 移动最慢。如在 电泳 鉴定 质粒 纯度时发现凝胶上有数条 脱氧核糖核酸 带难以确定是质粒DNA不同构象引起还是因为含有其他DNA引起时,可从 琼脂糖 凝胶上将DNA带逐个回收,用同一种限制性内切酶分别 水解 ,然后电泳,如在凝胶上出现相同的DNA图谱,则为同一种DNA。

电源电压

在低电压时,线状 DNA 片段的迁移 速率 与所加电压成正比。但是随着 电场 强度的增加,不同分子量的DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长,片段越大,因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大,因此电压增加, 琼脂糖 凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的 脱氧核糖核酸 片段有效分离所加电压不得超过5V/cm。

嵌入染料的存在

荧光染料 溴化 乙 用于检测 琼脂糖 凝胶中的DNA,染料会嵌入到堆积的 碱基对 之间并拉长线状和带缺口的环状DNA,使其刚性更强,还会使线状DNA迁移率降低15%。

离子强度影响

电泳 缓冲液的组成及其离子强度影响 DNA 的电泳迁移率。在没有离子存在时(如误用蒸馏水配制凝胶), 电导率 最小,DNA几乎不移动,在高离子强度的缓冲液中(如误加10×电泳缓冲液),则电导很高并明显产热,严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。

对于天然的 双链 脱氧核糖核酸 ,常用的几种电泳缓冲液有TAE[含 乙二胺四乙酸二钠 (pH8.0)和 三羟甲基氨基甲烷 乙酸 ],TBE(Tris- 硼酸 和EDTA), TPE (Tris-磷酸和EDTA),一般配制成浓缩母液,储于室温。