琼脂 糖(agarose),是一种线性的聚合物 ,是由琼脂分离制备的链状 多糖 ,是琼脂的两个组成部分之一,由D-呲喃 半乳糖 和3,6-脱水-L- 吡喃 半乳糖两种单位交替排列而成 。
琼脂糖为白色或微黄色粉末,珠状或不规则细条状 ;结构是左手双螺旋的平行链,具有三重螺旋轴。琼脂糖不溶于冷水 ,但溶于热水 ,当加热到90℃以上时,可以完全溶解。1%或2%的琼脂糖溶液,加热溶解后,当温度降低到40℃至50℃时,可以形成良好的半固体状凝胶,这是琼脂糖许多功能和用途的基础 。
琼脂糖的优点是 电泳 速度快,疏松的网状结构,允许分子量达100万的大分子自由通过;低浓度的琼脂糖电泳相当于自由界面电泳, 蛋白质 在 电场 中可自由穿透,阻力小,分离清晰;透明度高,能透过200至700纳米波长的光线 。琼脂糖可用于食品中, 果冻 、软糖等食物中都含有琼脂糖 。
概述
琼脂 糖Agarose,缩写为AG,是琼脂中不带电荷的中性组成成份,也译为 琼胶 素或琼胶糖。琼胶糖化学结构是由1,3连结的β-D- 半乳糖 和1,4连结的3,6- 内醚 L-半乳糖交替连接起来的长链构成。
来源于 红藻 的 多糖 ,其主要成分为多聚半乳糖,其中约70%为琼脂糖,30%为支链琼脂糖。琼脂糖具线型结构,由D-半乳糖和3,6-脱水半乳糖通过β-1,4和α-1,3连接交替形成重复 二糖 单位。支链琼脂糖则从β-1,3键分出另一链。用热水从海藻抽提的物质约含40% 琼脂 。市售的琼脂(俗称 洋菜 )常呈片状或疏松绳索状,通常作食用胶质,药物包装剂或细菌培养基使用。纯制的琼脂糖常在生物化学实验室中,作为 电泳 、层析等技术中的半固体支持物,用于生物大分子或小分子物质的分离和分析。
琼脂,它的英文名为 agar 。这个词来源于 马来语 的 agar- agar,意思是胶状物。又名 琼胶 、菜燕、 冻粉 ,是一类从 石花菜 及其它 红藻 类( 红藻纲 )植物提取出来的藻胶(phycocottoid),在我国及 日本 已有三百多年(1658年)的历史。中国人亦称为 琼脂 或冻粉。日本人称之为 寒天 (kanten),因为它在冬天收获。台湾人叫它菜燕,和 燕窝 的质感差不多。 韩国 的叫法是??(不知道啥意思)。
琼脂 作为一种独特的食品在我国已经有悠久的历史。它是从大型 海洋藻类 石花菜 、紫菜、 江篱 等提取分离制成的,广泛应用于食品和生化等行业。我们常吃的 果冻 、 冰淇淋 、 糕点 、软糖、罐头、八宝粥中都含有琼脂。我国的 山东省 、 福建省 、 广东省 、 海南省 等拥有优越的海洋资源和气候条件,适宜大型海洋藻类的生长,是生产 琼脂 的主要地区,产品远销世界各地。
琼脂是由琼脂糖(agarose)和琼脂 果胶 (agaropectin)组成的。 琼脂 糖是线性的多聚物,琼脂果胶是由许多更小的分子组成的异质 混合物 。它们的结构相似,但带 硫酸根 和 羧基 组分,凝胶能力差。
计算化学数据
1.疏水参数计算参考值(XlogP):无
2. 氢键 供体数量:0
3.氢键受体数量:1
4.可旋转 化学键 数量:6
5.互变异构体数量:7
6.拓扑分子极性表面积17.1
7.重原子数量:15
8.表面电荷:0
9.复杂度:178
11.确定原子立构中心数量:0
12.不确定原子立构中心数量:0
13.确定化学键立构中心数量:0
14.不确定化学键立构中心数量:0
15. 共价键 单元数量:1
物化信息
中文名称:琼脂糖
中文别名:琼脂糖ME
英文名称:Agarose
英文别名:Agarose, medium EEO, Molecular Biology Grade; agarose, mixture; Agaroseforelectrophoresisofmacromolecules;agarose for molecular biology ; agarose 6 B for chromatography; Agarose LE; sepharose(R) 4B for chromatography;
CAS:9012-36-6;62610-50-8
EINECS:232-731-8
分子式:C24H38O19
分子量:630.5471
安全术语:S24/25:Avoid contact with skin and eyes.;
物化性质
熔点 :260-481.5℃
相对密度:1.81g/cm3
凝胶性能
琼脂糖在水中一般加热到90℃以上溶解。琼脂糖凝胶性能通常用凝胶强度表示。强度越高,凝胶性能越好。质量较好的琼脂糖强度通常在1200克/cm2以上(1%胶浓度)。琼脂糖的凝胶性是由存在的 氢键 所致,凡是能破坏氢键的因素都能导致凝胶性的破坏。琼脂糖具有亲水性,并几乎完全不存在带电基团,对敏感的生物大分子极少引起变性和 吸附 ,是理想的惰性载体。在 琼脂 糖制备过程中需要把琼脂 果胶 尽量去除,否则琼脂糖有可能存在极微量 硫酸根 和丙酮[tóng]酸取代 电离 基团,就会造成电内渗(EEO),电内渗对质点的移动产生影响。质量较好的琼脂糖硫酸根含量比较低,通常在0.2%以下,电内渗比较小,通常在0.13以下。这也就是琼脂糖比琼脂贵那么多的原因了。
1937年荒木第一次从琼脂中分离出琼脂糖,但直到1961年Hjertin首先发现了琼脂糖优异的使用性能后才引起了越来越多的关注,并开始工业生产。琼脂糖广泛应用于临床化验、生化分析和生物大分子物质的分离等领域。
用途
琼脂 、琼脂糖因为有特殊的胶凝性质,尤其有显著的稳固性、滞度和滞后性,并且易吸收水分,有特殊的稳定效应;已经广泛使用于食用、医药、化工、纺织、国防等领域,据不完全统计,琼脂、琼脂糖的用途已有1000多种,被国际上称为“新奇的东亚产品”。在食品工业中可用于生产: 水晶 软糖、定型软糖、水产品、 肉类罐头 、 果汁饮料 、果肉饮料、 米酒 饮料、乳品饮料、精品、乳品 蛋糕 。
由于其良好的生物相容性又广泛用于生物分离介质的生产。
简单地说,把 琼脂 中的琼脂 果胶 去掉,剩下的部分,就是琼脂糖。
电泳技术
特点
天然琼脂( agar )是一种 多聚糖 ,主要由琼脂糖(agarose,约占80%)及琼脂胶(agaropectin)组成。琼脂糖是由 半乳糖 及其衍生物构成的中性物质,不带电荷,而琼脂胶是一种含 硫酸根 和 羧基 的强酸性 多糖 ,由于这些基团带有电荷,在 电场 作用下能产生较强的电渗现象,加之硫酸根可与某些 蛋白质 作用而影响电泳速度及分离效果。因此,目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳,其优点如下。
(1)琼脂糖凝胶 电泳 操作简单,电泳速度快,样品不需事先处理就可以进行电泳。
(2)琼脂糖凝胶结构均匀,含水量大(约占98%~99%),近似自由电泳,样品扩散较自由电流,对样品 吸附 极微,因此电泳图谱清晰,分辨率高,重复性好。
(3)琼脂糖透明无紫外吸收,电泳过程和结果可直接用紫外光灯检测及定量测定。
(4)电泳后区带易染色,样品极易洗脱,便于定量测定。制成干膜可长期保存。
目前,常用琼脂糖作为 电泳 支持物,分离 蛋白质 和同工酶。将琼脂糖 电泳 与免疫 化学 相结合,发展成免疫电泳技术,能鉴别其他方法不能鉴别的复杂体系,由于建立了超微量技术,0.1ug蛋白质就可检出。
琼脂糖 凝胶电泳 也常用于分离、鉴定 核酸 ,如 脱氧核糖核酸 鉴定,DNA限制性内切核酸酶图谱制作等。由于这种方法操作方便,设备简单,需样品量少,分辨能力高,已成为 基因工程 研究中常用实验方法之一。
DNA电泳
琼脂糖凝胶电泳对核酸的分离作用主要是依据它们的相对分子量质量及分子构型,同时与凝胶的浓度也有密切关系。
1.核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系
(1) DNA分子 的大小 在凝胶中,DNA片段迁移距离(迁移率)与 碱基对 的 对数 成反比,因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离时行比较,便可测出未知片段的大小。但是当 脱氧核糖核酸 分子大小超过20kb时,普通琼脂糖凝胶就很难将它们分开。此时 电泳 的迁移率不再依赖于分子大小,因此,就用琼脂糖 凝胶电泳 分离 DNA 时,分子大小不宜超过此值。
(2) 琼脂 脂糖的浓度 如下表所示,不同大小的DNA需要用不同浓度的琼脂糖凝胶进行 电泳 分离。
表 琼脂糖浓度与DNA分离范围
琼脂糖浓度 /% 0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0
线状DNA大小/kb60-520-110-0.87-0.56-0.44-0.23-0.1
2. 核酸 构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系
不同构型 脱氧核糖核酸 的移动速度次序为:供价闭环 DNA(covalently closed circular,cccDNA)>直线DNA>开环的双链环状DNA。当琼脂糖浓度太高时,环状DNA(一般为球形)不能进入胶中,相对迁移率为0(Rm=0),而同等大小的直线 双链DNA (刚性棒状)则可以长轴方向前进(Rm>0),由此可见,这三种构型的相对迁移率主要取决于凝胶浓度,但同时,也受到电流强度、缓冲液离子强度等的影响。
3. 电泳 方法
(1)凝胶类型
用于分离 核酸 的琼脂糖 凝胶电泳 可分为垂直型及水平型(平板型)。水平型电泳时,凝胶板完全浸泡在电极缓冲液下1-2mm,故又称为潜水式。目前更多用的是后者,因为它制胶和加样比较方便,电泳槽简单,易于制作,又可以根据需要制备不同规格的凝胶板,节约凝胶,因而较受欢迎。
(2)缓冲液系统
缺少离子时,电流太小, 脱氧核糖核酸 迁移慢;相反,高离子强度的缓冲液由于电流太大会大量产热,严重时,会造成胶熔化和DNA的变性。
常用的电泳缓冲液有 乙二胺四乙酸二钠 (pH8.0)和 三羟甲基氨基甲烷 乙酸 (TAE),Tris- 硼酸 (TBE)或Tris-磷酸( TPE )等,浓度约为50mmol/L(pH7.5~7.8)。 电泳 缓冲液一般都配制成浓的贮备液,临用时稀释到所需 倍数 。
TAE缓冲能力较低,后两者有足够高的缓冲能力,因此更常用。TBE浓溶液长期贮存会出现沉淀,为避免此缺点,室温下贮存5×溶液,用时稀释10倍0.5×工作溶液即能提供足够缓冲能力。
(3)凝胶的制备
以稀释的电极缓冲液为 溶剂 ,用沸水浴或微波炉配制一定浓度的溶胶,灌入水平胶框或垂直胶膜,插入梳子,自然冷却。
(4)样品配制与加样
脱氧核糖核酸 样品用适量 乙酰丙酮铁 乙二胺四乙酸二钠 缓冲液溶解,缓冲液内含有0.25% 溴酚蓝 或其他指示 染料 ,含有10%-15% 蔗糖 或5%~10% 丙三醇 ,以增加其比重,使样品集中。为避免蔗糖或甘油可能使 电泳 结果产生U形条带,可改用2.5%Ficoll( 聚蔗糖 )代替蔗糖或甘油。
(5)电泳
琼脂糖凝胶分离大分子DNA实验条件的研究结果表明,在低浓度、低电压下,分离效果较好。在低电压条件下,线性 DNA分子 的电泳迁移率与所用的电压呈正比。但是,在 电场 强度增加时,较大的 脱氧核糖核酸 片段迁移率的增加相对较小。因此随着电压的增高,电泳分辨率反而下降,为了获得电泳分离DNA片段的最大分辨率,电场强度不宜高于5V/cm。
电泳 系统的温度对于DNA在琼脂糖凝胶中的电泳行为没有显著的影响。通常在室温下进行电泳,只有当凝胶浓度低于0.5%时,为增加凝胶硬度,可在4℃进行电泳。
(6)染色和拍照
常用 荧光染料 溴乙锭 (EB)染色,在紫外光下观察 DNA 条带,用紫外分析仪拍照,或用凝胶成像系统输出照片,并进行有关的数据分析。
转移电泳
生物化学与分子生物学的研究工作经常需要对 电泳 分离后的 脱氧核糖核酸 进行分子杂交,但琼脂糖不适合于进行杂交操作,1975年,Southren创造了将DNA区带原位转移到 硝酸基 纤维素 膜(NC膜)上,再进行杂交的方法,被称为Southren印迹法。随后,Alwine等将类似方法用于 核糖核酸 印迹,被戏称为Northern印迹,1979年Towbin等设计了将 蛋白质 从凝胶转移到 硝化纤维素 膜的装置,将蛋白质转移到膜上,再与相应的抗体等 配体 反应,被戏称为Western印迹,这种装置将膜和凝胶、滤纸等制成 夹心饼干 状,用低电压高电流 电泳 完成转移。1982年Reinhart等用电转移法将等电聚焦后的蛋白质区带从凝胶转移到特定膜上,称Eastern印迹。
目前国内外有多种 核酸 、蛋白质印迹转移的电泳装置出售,使印迹转移速度快效率高、重复性好,应用更加广泛。 聚丙烯酰胺 凝胶也可用于印迹转移电泳,但转移 蛋白质 时,凝胶中不可含有 SDS 、 尿素 等 变性剂 。用于转移电泳的支持膜亦有多种选择,近些年用尼龙膜较多,因为尼龙膜机械性能好,烘烤不变脆,使用时比 硝化纤维素 膜更方便。
进行印迹转移 电泳 时,要注意缓冲液的离子强度要低,pH要远离pI,使蛋白质带有较多电荷,一般用稳定性较好的 三羟甲基氨基甲烷 缓冲体系。还要注意凝胶与支持膜之间有能有气泡。适当提高电压或电流可以提高转移速度,但亦会增加热效应,故电压或电流不可过高。
凝胶电泳
一般琼脂糖凝胶电泳只能分离小于20kb的 脱氧核糖核酸 。这是因为在琼脂糖凝胶中, DNA分子 的有效直径超过凝胶孔径时,在 电场 作用下,迫使DNA变形挤过筛孔,而沿着泳动方向伸直,因而分子大小对迁移率影响不大。如此时改变电场方向,则DNA分子必须改变其构象,沿新的泳动方面伸直,而转向时间与DNA分子大小关系极为密切。1983年Schwartz等人根据DNA分子弹性弛豫时间(外推为0的滞留时间)与DNA分子大小有关的特性,设计了脉冲电场 梯度 凝胶,交替采用两个垂直方向的不均匀电场,使DNA分子在凝胶中不断改变方向,从而使DNA按分子大小分开。后来Carle等改进了 电泳 技术,并发现周期性的反转换 电场 (periodic inversion of the electric field)亦能使大分子 脱氧核糖核酸 通过电泳分开。电泳系统是由一水平式电泳槽和两组独立、彼此垂直的电极组成,一组电极负极为N,正极为S;另一组负极为W,正极为E。一块正方形琼脂糖凝胶板(10cm*10cm或20cm*20cm)呈45度放中央。电场在N-S和W-E之间交替建立。电场交替改变的时间长短与欲分离的DNA分子大小有关。
电泳 时,DNA分子处在连续间隔交替的 电场 中。首先向S极移动,然后改向E极。在每次电场方向改变时,DNA分子就要有一定的时间松弛,改变形状和迁移方向。只有当 脱氧核糖核酸 分子达到一定构型后,才能继续前时。DNA分子净移动方向与加样线垂直,使样品中各组分沿同一泳道形成各自的区带。交变脉冲电泳可有效分离数百万碱基对的大分子DNA。较新式的仪器电极间的角度和脉冲时间均可调,使用更加方便。
此外,琼脂糖平板常用于免疫扩散技术的 电泳 技术相结合的多种免疫电泳。