凯氏定氮法是由 丹麦 化学家凯道尔于1883年建立的。现已发展为常量、微量、平微量凯氏定氮法以及自动定氮仪法等，是分析 有机化合物 含氮量的常用方法。凯氏定氮法的理论基础是 蛋白质 中的含氮量通常占其总质量的16%左右(12%~一19%),因此，通过测定物质中的含氮量便可估算出物质中的总蛋白质含量(假设测定物质中的氮全来自蛋白质)，即: 蛋白质含量=含氮量/16%。
凯氏定氮法是测定化合物或 混合物 中总氮量的一种方法。即在有 催化剂 的条件下，用 硫酸 消化样品将有机氮都转变成 无机化合物 盐，然后在碱性条件下将铵盐转化为氨，随水蒸气蒸馏出来并为过量的 硼酸 液吸收，再以标准 盐酸 滴定 ，就可计算出样品中的氮量。由于 蛋白质 含氮量比较恒定，可由其氮量计算蛋白质含量，故此法是经典的蛋白质定量方法。
原理
蛋白质是含氮的 有机化合物 。蛋白质与 硫酸 和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成 硫酸铵 。然后碱化 蒸馏 使氨游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸 标准溶液 滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，并换算成蛋白质含量。含氮量*6.25=蛋白含量
. 有机化合物 中的胺根在强热和 ，浓 作用下，硝化生成 反应式为：
（其中 做 催化剂 ）
2.在凯氏定氮器中与碱作用，通过蒸馏释放出 ，收集于 溶液中
反应式为:
3. 用已知浓度的 （或 ） 标准溶液 滴定 ，根据HCI消耗的量计算出氮的含量，然后乘以相应的换算因子，既得 蛋白质 的含量
反应式为：
试剂
所有试剂均用不含氨的 蒸馏水 配制。
2.1 硫酸铜 。
2.2 硫酸钾 。
2.3 硫酸 。
2.4 2% 硼酸溶液 。
2.5 混合指示液：1份0.1% 甲基红 乙醇 溶液与5份0.1% 溴甲酚绿 乙醇溶液临用时混合。也可用2份0.1%甲基红乙醇溶液与1份0.1% 次甲基 蓝乙醇溶液临用时混合。
2.6 30% 氢氧化钠 。
2.7 0.025mol/L硫酸 标准溶液 或0.05mol/L 盐酸 标准溶液。
仪器
定氮 蒸馏 装置:
如图 所示。
1.安全管
2.导管
3.汽水分离管
4.样品入口
5.塞子
6.直型 冷凝管
7.吸收瓶
8.隔热液套
9.反应管
10.蒸汽发生瓶
操作
1、 样品处理：精密称取0.2-2.0g固体样品或2-5g半固体样品或吸取10-20ml液体样品（约相当氮30-40mg），移入干燥的100ml或 500ml 定氮瓶中，加入0.2g 硫酸铜 ，6g 硫酸钾 及20毫升硫酸，稍摇匀后于瓶口放一小漏斗，将瓶以45度角斜支于有小孔的 石棉 网上，小火加热，待内容物全部 碳化 ，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色澄清透明后，再继续加热0.5小时。取下放冷，小心加20ml水，放冷后，移入100ml 容量瓶 中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至 刻度 ，混匀备用。取与处理样品相同量的硫酸铜、硫酸钾、 浓硫酸 同一方法做试剂空白试验。但是此法比较危险，不易在实验室演示，大多数实验室有消煮仪一次可以进行多个（一次可以消煮16个样品）样品处理，并有通风橱进行通风，温度可以自己设定，更加安全和可操作性，因此逐步成为主要的凯氏定氮法的首选处理方法。
一般消解温度都设在240度及240度以上，如果想快速消解可以适当提高温度甚至可以用最大温度进行消解。
2、 按图装好定氮装置，于 蒸汽 发生器内装水约2/3处加 甲基红 指示剂 数滴及数毫升 硫酸 ，以保持水呈酸性，加入数粒玻璃珠以防 暴沸 ，用 调压器 控制，加热煮沸水蒸气发生瓶内的水。
3、 向接收瓶内加入10ml 2% 硼酸溶液 及 混合指示剂 1滴，并使 冷凝管 的下端插入液面下，吸取10.0ml样品消化液由小 玻璃 杯流入反应室，并以10ml水洗涤小 烧杯 使流入反应室内，塞紧小玻璃杯的棒状玻璃塞。将10ml 40% 氢氧化钠 倒入小玻璃杯，提起玻璃塞使其缓慢流入反应室，不能立即将玻璃盖塞紧，这样易使玻璃塞粘在进样口，应先用 蒸馏水 冲洗然后再盖，并加水于小玻璃杯以防漏气。夹紧 尾旋 夹，开始 蒸馏 ，蒸气通入反应室使氨通过冷凝管而进入接收瓶内，蒸馏5min。移动接收瓶，使 冷凝管 下端离开液皿，再蒸馏1min，然后用少量水冲洗冷凝管下端外部。取下接收瓶，以0.05N 硫酸 或0.05N 盐酸 标准溶液 定至灰色或蓝紫色为终点。
同时吸取10.0ml试剂空白消化液按3操作。
计算
X：样品中 蛋白质 的百分含量，g；
：样品消耗硫酸或盐酸标准液的体积，ml；
：试剂空白消耗硫酸或盐酸标准溶液的体积，ml；
N：硫酸或盐酸标准溶液的当量浓度；
0.014：1N 硫酸 或 盐酸 标准溶液 1ml相当于氮克数；
m：样品的质量（体积），g（ml）；
F：氮换算为蛋白质的系数 。 蛋白质中的氮含量一般为15～17.6%，按16%计算乘以6.25即为蛋白质， 乳制品 为6.38，面粉为5.70，玉米、高粱为6.24，花生为5.46，米为5.95，大豆及其制品为5.71，肉与肉制品为6.25， 大麦 、小米、燕麦、 黑麦 为5.83，芝麻、向日葵为 5.30。
注意
（1）样品应是均匀的。固体样品应预先研细混匀，液体样品应振摇或搅拌均匀。
（2）样品放入定氮瓶内时，不要沾附颈上。万一沾附可用少量水冲下，以免被检样消化不完全，结果偏低。
（3）消化时如不容易呈透明溶液，可将定氮瓶放冷后，慢慢加入30% 过氧化氢 （ ）2-3ml，促使氧化。
（4）在整个消化过程中，不要用强火。保持和缓的沸腾，使火力集中在凯氏瓶底部，以免附在壁上的 蛋白质 在无 硫酸 存在的情况下，使氮有损失。
（5）如硫酸缺少，过多的 硫酸钾 会引起氨的损失，这样会形成 硫酸氢钾 ，而不与氨作用。因此，当硫酸过多的被消耗或样品中脂肪含量过高时，要增加硫酸的量。
（6）加入硫酸钾的作用为增加溶液的 沸点 ， 硫酸铜 为 催化剂 ，硫酸铜在 蒸馏 时作碱性反应的 指示剂 。
（7） 混合指示剂 在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈红色。如果没有 溴甲酚绿 ，可单独使用0.1% 甲基红 乙醇 溶液。
（8）氨是否完全蒸馏出来，可用pH试纸试馏出液是否为碱性。
（9）吸收液也可以用0.01当量的酸代表 硼酸 ，过剩的酸液用0.01N 碱液 滴定 ，计算时，A为试剂空白消耗碱液数，B为样品消耗碱液数，N为碱液浓度，其余均相同。
（10）以硼酸为氨的吸收液，可省去标定碱液的操作，且硼酸的体积要求并不严格，亦可免去用 移液管 ，操作比较简便。
（11）向 蒸馏 瓶中加入浓碱时，往往出现 褐色 沉淀物 ，这是由于分解促进碱与加入的 硫酸铜 反应，生成 氢氧化铜 ，经加热后又分解生成氧化铜的沉淀。有时铜离子与氨作用，生成深l蓝色的结合物
（12）这种测算方法本质是测出氮的含量，再作 蛋白质 含量的估算。只有在被测物的组成是蛋白质时才能用此方法来估算蛋白质含量。