2+和Mg2+可增加上述酶对PHFII-tau的去磷酸化作用。 ADP- tau的去磷酸化反应条件除用较低的磷酸酶浓度外［8，9］，其余同PHFII-tau的去磷酸化条件。一、 pp 2A和PP-2B可在多部位使PHFII-tau去磷酸化
正文
探讨阿尔 茨 海默病(AD) 脑损伤 逆转的可能性及其途径。方法 用去磷酸化和免疫印迹法研究AD脑损伤可逆性。结果 蛋白磷酸 酶(PP)-2A和 PP- 2B可使AD神经原纤维缠结中的II型双螺旋丝（PHFII-tau）在Ser-199/Ser-202去磷酸化，Ser-396/Ser-404部分去磷酸化；此外，PP-2A和PP-2B可分别使PHFII-tau的Ser-46和Ser-235去磷酸化；去磷酸化后PHFII-tau的相对 电泳 迁移率加快。 可增加上述酶对PHFII-tau的去磷酸化作用。酶的去磷酸化作用具有浓度依赖性，随着酶浓度的增加，去磷酸化作用增强。结论 因为tau蛋白异常过度磷酸化并形成PHF被认为是AD神经原纤维退化的基础，PHF可在体外被蛋白磷酸酯酶去磷酸化的结果提示，AD 脑损伤 可能是可逆的。
阿尔茨海默(AD)脑中有三种tau蛋白：(1)易溶型非异常磷酸化的tau(C-tau)；(2)易溶型异常磷酸化的 tau (ADp-tau)；(3)以双螺旋丝聚集的tau(PHF-tau)。根据PHF-tau在 月桂醇硫酸钠 ( SDS )中的溶解性，又可将其分为PHFI-tau和PHFII-tau［1］。与ADp-tau和PHFI-tau不同，PHFII-tau还被部分泛素化修饰［2］。
根据Cohen［3］的分类法，大量存在于人脑中的磷酸丝氨 和磷酸苏氨酰蛋白磷酸酯酶主要包括四种类型: pp 1，PP-2A，PP-2B和PP-2C。从过去的研究中发现，PP-2C不使所研究的ADp-tau任何位点发生去磷酸化作用，而PP-1仅对少数位点起反应［4］。推测PP-2A和PP-2B可能在AD脑中tau异常磷酸化过程中起关键作用，所以二者均被选用于本研究。
对象和方法
一、组织和抗体来源
该研究中的AD及年龄、性别匹配对照者的脑组织来源于死后6小时内的尸体解剖(各取6例混合后制备匀浆)，AD确诊基于尸检组织切片的 病理学 检查，人脑组织均贮于 直至使用。牛脑 PP- 2A和PP-2B的分离纯化分别参照Cohen等［5］和Sharma等［6］的方法。多克隆抗体92e和102C由Iqbal小组制备。单克隆抗体tau-1和PHF-1分别由Binder和Greenberg提供。单克隆抗体SMI-31，SMI-33和SMI-34从Sternberg单克隆公司购买。碱性磷酸酶标记的抗鼠和抗兔IgG从Sigma公司购买。
二、tau蛋白样品的制备
PHFII-tau蛋白制备参照Iqbal等［7］的长程序从AD患者脑中制备。其简要步骤如下：将AD大脑皮质去脑膜及白质后制备匀浆，再用不同孔径尼龙膜进行筛分，在2% SDS溶液 中加热和超声破碎，不连续 蔗糖 密度 梯度 离心和玻璃珠层析。 巴黎-奥利机场 tau的制备参阅Kopke等［1］法。
三、去磷酸化反应
除特别标明外，去磷酸化反应均在 进行45分钟。反应混合液中含50mmol/LTris-HCl(pH7.0)，20mmol/Lβ- 2-巯基乙醇 ，0.1g/L 牛血清蛋白 ，1.0mmol/LMn Cl2 ;各0.01g/L抑肽酶(aprotinin)，Leupeptin和 胃酶抑素 (pepstatin)，0.07g/LPHF-Ⅱ-tau，2U/ml pp 2A或5U/mlPP-2B(1单位PP-2A或PP-2B分别指在30℃，每分钟 催化 磷酸化酶 a或磷酸化酶激酶释放1.0nmol磷酸的酶量)。在用PP-2B进行的去磷酸化反应液中，还含有1mmol/LCaCl2和1μmol/L钙调素。 ADP- tau的去磷酸化反应条件除用较低的磷酸酶浓度外 ，其余同PHFII-tau的去磷酸化条件。去磷酸化位点的检测用免疫印迹法。
四、免疫印迹法
经去磷酸化处理的样品先用4倍体积预冷丙 进行沉淀，再溶于 SDS- PAGE( 聚丙烯酰胺 凝胶电泳 )样品缓冲液，煮沸5分钟后进行 。所用一级抗体的稀释 倍数 及特性见附表。印迹样品用碱性磷酸酶标记的抗鼠或抗兔IgG作为第二抗体，以5-溴-4-氯-3 吲哚 磷酸-对 氨基 甲苯 盐( BCIP )和对硝基蓝 四唑 氯(NBT)作为底物进行显色分析。
结果
一、 pp 2A和PP-2B可在多部位使PHFII-tau去磷酸化
PP-2A(2U/ml)和PP-2B(5U/ml)可使PHFII-tau的tau-1表位显色，PP-2A和PP-2B还分别使PHFII-tau的Ser-46和Ser-235去磷酸化。两种酶均使
相关词条
顺式作用元件基因领域效应分子遗传学外显子松果腺分子杂交
参考链接
1、http://www.helix net. cn/archiver/tid-2721 HTML
2、http://scitech.people.com.cn/GB/other2137/
3、http://book. 新浪 com. cn/nzt/spi/gongzuo dna /