反转录酶(reverse transcriptase,也可写成逆转录酶)又称为依赖 核糖核酸 的 脱氧核糖核酸 聚合酶 。1970年Temin等在致癌 RNA病毒 中发现了一种特殊的 DNA 聚合酶，该酶以RNA 为模板，以 dNTP 为 底物 ， 转运RNA ( 主要是 色氨酸 tRNA) 为 引物 ，在tRNA 3' -OH 末端上，根据 碱基 联会 的原则，按5'-3'方向合成一条与RNA 模板互补的DNA 单链，这条DNA 单链叫做互补DNA (complementary DNA，CDNA)。
反转录酶（Reverse transcriptase）是以 核糖核酸 为模板指导三磷酸脱氧核 酸合成互补 脱氧核糖核酸 （cDNA）的酶。 哺乳类 C型病毒的反转录酶和鼠类 B型 病毒的反转录酶都是一条多肽链。鸟类 RNA病毒 的反转录酶则由两上亚基结构。 真核生物 中也都分离出具有不同结构的反转录酶。
简介
多反转录酶都具有多种酶活性，主要包括以下几种活性。
①RNA指导的DNA 聚合酶 活性；以 RNA 为模板， 催化 dNTP 聚合成 DNA 的过程。此酶需要RNA为 引物 ，多为 色氨酸 的 转运RNA ，在引物tRNA3′－末端以5′→3′方向合成 脱氧核糖核酸 。反转录酶中不具有3′→5′外切酶活性，因此没有校正功能，所以由反转录酶催化合成的DNA出错率比较高。
②RNase H活性；由反转录酶催化合成的cDNA与模板 核糖核酸 形成的杂交分子，将由RNase H从RNA5′端水解掉RNA分子。
③ DNA 指导的DNA 聚合酶 活性；以反转录合成的第一条DNA单链为模板，以 dNTP 为 底物 ，再合成第二条 DNA分子 。
除此之外，有些反转录酶还有DNA内切酶活性，这可能与病毒基因整合到 宿主 细胞 染色体 DNA中有关。反转录酶的发现对于遗传 工程技术 起了很大的推动作用，目前它已成为一种重要的工具酶。用组织细胞提取mRNA并以它为模板，在反转录酶的作用下，合成出互补的 脱氧核糖核酸 (cDNA)，由此可构建出cDNA文库(cDNa library)，从中筛选特异的目的基因，这是在基因工程技术中最常用的获得目的基因的方法。
实例
这是一种莫洛尼鼠白血病病毒(Moloneymurineleukeminvirus)反转录酶(简称M-MLVRTase)，这个酶已经作了遗传性上的改变，即除去了与它联在一起的 核糖核酸酶 H活性(一种专门切割 DNA 与 核糖核酸 杂交链上RNA分子的酶)。这个酶应用于cDNA的第一链合成和 引物 的延伸。这种酶需要镁离子或锰离子作为辅助因子，当以mRNA为模板时，先合成 单链DNA （ssDNA），再在反转录酶和DNA 聚合酶 Ⅰ作用下，以单链DNA为模板合成“发夹”型的 双链DNA （dsDNA），再由 核酸酶 S1切成二条单链的双链DNA。因此，反转录酶可用来把任何基因的mRNA反转录成cDNA拷贝，然后可大量扩增插入载体后的cDNA。也可用来标记cDNA作为放射性的分子 探针 。
逆 转录 酶（M-MLV）从MoloneyMurine Leukemia Virus分离出来，可用于合成第一链cDNA、制作cDNA探针、 核糖核酸 转录、测序和RNA的逆转录反应。本酶是通过 点突变 使 RNa seH活性缺失，所以它具有的 脱氧核糖核酸 聚合酶 的活性与野生型相同，同时其延伸能力也有显著提高。逆转录酶（M-MLV）一个活性单位定义为在37℃，10min条件下，使1nmol的 脱氧核糖核酸 掺入酸性沉淀物质所需的酶量。
合成步骤
1、使用前每个组份轻轻混匀，然后2000rpm 离心 20s
2、取灭过菌且无 核酸酶 的0.2ml 离心管 ，依次加入2～5μgRNAnμL
3、65℃保温5min，然后冰浴5min；
4、往3步骤中的0.2ml离心管依次加入下列组份
RNase抑制剂 （40u/μL）0.5μL
10×M-MLVReactionBuffer2μL
二硫苏糖醇 （200mM）1μL
逆转录酶（M-MLV）1μL
5、轻轻混匀后，然后2000rpm离心20s；
6、先在37℃保温1hr，然后70℃保温15min；
7、上述产物可立即进行下一步的PCR反应或-20℃保存。
质量控制
1.切口酶：在与200单位酶37oC保温60分钟后， 超螺旋 质粒 保留在90%以上。
2.DNase测定：200单位酶与50ng3H- 脱氧核糖核酸 37oC保温60分钟，分解出的放射性低 于1%。
3.RNase测定：200单位酶与50ng3H- 核糖核酸 37oC保温60分钟，分解出的放射性低
于3%。
4.第一链cDNA的反应：在标准化的反应中，200单位酶催化从1mg1.2kbRNA或
1mg7.5kbRNA将 同位素 掺入到cDNA中，通过放射自显影，对于1.2kb的RNA，产物
cDNA是单一的、全长的条带。对于7.5kb的RNA产物有部分是全长的条带。用这二种
RNA 放射性转换到cDNA中有12%。
5.RNaseH活性：200单位酶与polyA:polydT37oC保温60分钟，释放出的放射
性要低于1%。
6.物理纯度：在 SDS－ PAGE上>90%纯。
储存缓冲液：20mM 三羟甲基氨基甲烷 HClpH7.5；200mMNaCl；0.1mM EDTA ；1mMDTT；0.01% NP 40(一种
反应缓冲液：250mM Tris- HClpH8.3；375mM KCl ；15mMMg Cl2 ；50mMDTT(以Part#M531A供应)。
使用说明
M-MLV反转录酶比AMV反转录酶缺乏连续性，因此要获得像AMV反转录酶反应中产生同样量的cDNA就要求使用较多单位的M-MLV反转录酶。用1微克的mRNA起始合成第一条链的cDNA，要用8单位的M-MLV反转录酶才相当于1单位的AMV反转录酶的作用。该酶很容易被 亚精胺 ( Spermidine )所抑制，该酶绝对不能用Promega的RiboprobeAMV反转录酶5X反应缓冲液，也不能用Promega的RiboclonecDNA第一条链缓冲液，因为这二种缓冲液均含有亚精胺。
注意事项
反转录酶
在进行RT反应之前，应考虑以下几个方面：
1、 核糖核酸
成功的cDNA合成来自高质量的 RNA ，高质量的RNA至少应保证全长并且不含逆转录酶的 抑制剂 ，如 EDTA 或SDS。在提取RNA的过程中，要特别防止RNase的污染，同时在逆转录反应中经常加入 RNase抑制剂 以增加cDNA合成的长度和产量。RNase抑制剂要在第一链cDNA合成反应中，在缓冲液和 还原剂 （如 二硫苏糖醇 ）存在的条件下加入，因为cDNA合成前的过程会使抑制剂 变性 ，从而释放结合的可以降解 RNA 的RNase。蛋白 RNa se 抑制剂 仅防止RNaseA，B，C对 核糖核酸 的降解，并不能防止皮肤上的RNase，因此尽管使用了这些抑制剂，也要小心不要从手指上引入RNase，实验过程中经常更换新手套。
2、 引物 的选择
OligodT
选择OligodT时，要求RNA必须有PolyA，所以 真核生物 的mRNA都适用。适合长链甚至全长m RNA 的RT，所以对RNA样品的质量要求较高，最好不要有明显的 脱氧核糖核酸 污染、RNA降解和RNA断裂。假如想探索新的mRNA进行RT反应，建议推荐使用OligodT引物。使用OligodT引物要比随机引物和特异性引物的稳定性要好。
随机引物
适合各种 核糖核酸 的RT，尤其适合模板 丰度 很低的情况（比如某个gene表达量很低）。选择随机 引物 时，第一链cDNA合成反应中就是以所有的 RNA 为模板，然后进行PCR反应时设计引物进行特异性扩增。同时要注意随机引物的量和总RNA量之间的关系，一般建议每5μg总RNA的随机引物的用量为50ng，如果每5μg总RNA的随机引物的用量超过250ng，可能会导致小片段产物（<500bp）的增加和长片断、全长产物产物的降低。
特异性引物
特异性引物只能用你设计引物时的下游引物做RT，引物设计质量影响RT的结果，而且不同引物 退火 温度本来就不相同，所以按照说明书按照一个温度做不是最佳选择，一般不推荐。
医学发展
细胞 的衰老和老化被认为和 染色体 末端由重复的 脱氧核糖核酸 （TTAGGG）序列所组成的端粒序列的丢失相关。随着细胞的每次分裂，端粒会丢失50～200bp，当端粒缩短到一定程度就不再保护染色体免受重组或降解， 细胞分裂 的 控制点 就此得到信号而产生作用，可使细胞分裂停止并进入老化过程致 细胞死亡 。端粒长度的维持即 重复序列 向染色体末端的添加由 端粒酶 所 催化 。端粒酶组成包括 核糖核酸 组分、端粒酶相关蛋白和端粒酶反转录酶。其中端粒酶反转录酶对端粒酶活性起关键作用。在人体，端粒酶活性存在于 干细胞 、 配子 、部分有再生能力的体细胞及绝大多数恶性肿瘤组织中。它的高活性是肿瘤 细胞 恶性增殖的一项重要条件，但其适量表达又具有延长细胞寿命的作用。随着干细胞分化的进行，端粒酶活性也随之降低，至终末分化细胞已无法测到端粒酶。适度上调和维持干细胞的端粒酶活性，对提高干细胞体外复制和扩增能力及揭示干细胞衰老机制都将具有重要意义。近期研究发现，在富含表皮干细胞的表皮 基底层 和生长期 毛囊 中均有 端粒酶 活性表达，但目前对不同发育阶段人表皮干细胞端粒酶表达特征仍缺乏相应的了解。弄清楚它们在表皮 干细胞 中的表达变化及其规律，将会增加对表皮干细胞的认识，获得更多有关表皮干细胞复制调控的新信息。
成功将人表皮干细胞体外分离培养的基础上，对比观察不同发育阶段人表皮干细胞端粒酶反转录酶表达的差异特征，结果表明人 胚胎 、少儿、成人皮肤来源的表皮干细胞均有端粒酶反转录酶表达，其表达强度依次减弱。提示诱导和增强端粒酶反转录酶的表达对维持表皮干细胞在体外自我更新和增殖能力可能具有重要意义。
社会效益
由它 催化 转录 合成的 脱氧核糖核酸 称为互补DNA(cDNA)。通常情况下，细胞内的转录应由DNA到 核糖核酸 的，所得RNA为信使RNA（mRNA）供蛋白质合成作模板用。而在部分RNA病毒中，要实现自身扩增，必须具有DNA，因此先由RNA逆转录合成cDNA再由cDNA转录出RNA。逆转录酶可用RT—PCR，将RNA转变为DNA后扩增，以获得RNA的序列。1970年从致癌RNA病毒中发现了反转录酶，并认为此酶与病毒的致癌性质有关。反转录酶也分布于某些正常 细胞 和 胚胎 细胞。反转录酶的发现表明不能把生物的遗传信息由 脱氧核糖核酸 →mRNA→ 蛋白质 绝对化，遗传信息也可以从RNA传递到DNA。它促进了 分子生物学 、 生物化学 和 病毒学 的研究，已成为研究这些学科的有力工具。