腺 酸环化酶(adenylyl cyclase)简称AC,是膜整合蛋白,能够 催化 ATP 生成cAMP,是 生物合成 cAMP的关键酶。
腺苷酸环化酶能够引起 细胞 的信号应答,是G蛋白偶联系统中的效应物,是细胞中信号传递途径的重要组成部分。Ⅰ型和Ⅲ型腺苷酸环化酶受钙离子与 钙调蛋白 的调控,而Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ型酶则不受其调控。
腺苷酸环化酶在整个 动物界 都存在,并广泛分布于 哺乳动物 的细胞膜中,在细胞调节中发挥不同的作用。在细菌中,如 百日咳 博德特氏菌、 炭疽杆菌 、 绿脓杆菌 或 鼠疫杆菌 的腺苷酸环化酶,可以响应于营养物而受到调节,或者它可以构成哺乳动物中的毒性因子。
体系
多肽 、 蛋白质 类及 儿茶酚 胺激素如 盐酸肾上腺素 、 胰高血糖素 、 胰岛素 、 促肾上腺皮质激素 、促 甲状腺素 等都是通过这一信息传递而发挥作用的。腺苷酸环化酶广泛分布于哺乳动物的细胞膜中,此酶催化 ATP 生成cAMP并释放 焦磷酸 。
激素和相应的膜受体结合后,经G蛋白的中介激活腺苷酸环化酶。 激素受体 嵌在 细胞 膜的脂双层内,它与激素结合的部位面向细胞外侧。腺苷酸环化酶也居质膜中,位于细胞内侧。
G蛋白位于细胞质膜胞浆面的一种外周蛋白,由3个亚基Gα、Gβ及Gγ,由于α亚基结构和作用不同,可分为 激动型G蛋白 和 抑制型G蛋白 两类。
激动型 G蛋白(Gs)未被激活前,Gα蛋白与GDP结合,呈无活性状态,一旦受体与激素结合后,即可诱发G蛋白上的Gα-GDP 与 GTP 交换,成为活性状态的Gα-GTP 。同时,Gα- GTP 即与Gβγ部分分离,并移动到邻近的βγ腺苷酸环化酶部位,以激活腺苷酸环化酶,后者 催化 ATP 变成 cAMP 。但Gα-GTP的寿命是短暂的,因为Gα本身具有GTP酶的活性,可以 水解 GTP为GDP与Pi。又成无活性的Gα-GDP,并返回与Gβγ结合成完整的无活性的G蛋白(a-βγ)-GDP。
另有一类G蛋白抑制型G蛋白(Gi),会抑制I,V,和VI亚型的AC的活性例如 胰岛素 、生长素抑制素通过Gi使细胞内cAMP浓度下降。但Gi对II和IV型则有正向刺激作用。
另外,Ca离子跟钙调蛋白( 钙调蛋白 )也可以激活ACI型与III和VIII型。
实验方法
腺苷酸环化酶主要分布于 细胞质 膜、 核膜 和 内质网 膜上。它也是一种 磷酸酶 ,能 催化 ATP 形成3',5'- 环磷酸腺苷 ( cAMP )并释放出 焦磷酸 。
Howell等人(1972)首先用亚胺二磷酸腺苷( AMP- PNP)作 底物 ,成功地对动物细胞中的腺苷酸环化酶进行了定位。现已确认,在未固定和固定的组织中, atp PNP是腺苷酸环化酶的专一性底物,在腺苷酸环化酶的作用下,能生成cAMP和PNP,后者与捕捉铅 离子反应 ,生成一种不溶性的电子密度很高的产物。但铅能在一定程度上抑制酶活性,为克服这一缺点, Fujiomto等(1981)设计了使用二钾亚 ( DMSO )的 硝酸铅 法。下面介绍的是Fujimoto等人使用的DMSO的硝酸铅法。
固定 :配制固定液的缓冲液使用0.1M pH为7.4的 二甲胂酸钠 缓冲液,内含8% 蔗糖 、5%的DMSO。
固定液配方 : 2% 多聚甲醛 和0.25% 戊二醛 混合液。对于肝脏来说,1%以上的戊二醛固定时,可导致明显的酶失活。但若加5%的DMSO,酶活性能较好保存。总体来说,多聚甲醛与戊二醛的浓度应因组织而异。一般在0~4℃固定2小时或室温固定1小时。
洗涤 :用配制固定液相同的缓冲液漂洗1小时~过夜,期间更换缓冲液数次;而后进行厚切片;
孵育 :配方及条件见\ ref {table: 水果酵素 7}.
作为腺苷酸环化酶特异 底物 的 AMP- PNP在室温中或长期冷冻保存时, ATP 、AMP-PN 和AMP- PNP-P 等化合物容易增多,应引起注意。 左旋咪唑 的加入是由于底物AMP-PNP 容易受到组织的 碱性磷酸酶 分解,加入左旋咪唑能抑制该酶的活性,在碱性磷酸酶活性高的组织内,左旋咪唑的浓度等因素需特别注意考虑。 氟化钠 为腺苷酸环化酶的 激活剂 ,应根据组织不同进行前处理后,将 化钠加入到孵育液中。
后固定 :后固定前,必须用不含 DMSO 的 二甲胂酸钠 缓冲液进行充分洗涤。
残存的DMSO可以与 四氧化锇 反应,产生扩散性的微细颗粒。后固定用二甲胂酸钠缓冲液配制的1%~2%的 酸。锇酸后固定时对酶反应产物有一定的影响,有人认为固定时间不应超过10min,超过后可引起酶反应产物颗粒变粗变大、扩散,有时由于全部溶出而导致完全没有反应产物的阴性结果。因此认为用锇酸固定时间最好控制在5分钟内。也有用2~4%的 戊二醛 代替锇酸进行后固定。
对照实验中可除去 底物 AMP- PNP,也可在对照实验的孵育液中加入5mM的 四氧嘧啶 。
DMSO 的 硝酸铅 法孵育液配方及条件table:Enzyme-7
孵育液配方:& 三羟甲基氨基甲烷 顺丁烯二酸 缓冲液(pH 7.4) 80mM
蔗糖 8%
氟化 20mM
茶碱 2.0mM
AMP- PNP 0.5mM
硫酸镁 4.0mM
左旋咪唑 2.5mM
DMSO 5%(V/V)
硝酸铅 2.0mM
孵育条件:孵育液pH 7.4
孵育温度 37℃