琥珀酸脱氢酶

TCA循环中整合于膜上的多亚基酶

琥珀酸脱氢酶(Succinate dehydrogenase,简称SDH), 黄素酶 类,属于细胞色素氧化酶,是 TCA 循环中唯一一个整合于膜上的多亚基酶,在 真核生物 中,结合于 线粒体 内膜,在 原核生物 中整合于细胞膜上,其是连接 氧化磷酸化 与电子传递的枢纽之一,可为 真核细胞 线粒体和多种 原核细胞 需氧和产能的呼吸链提供电子,为线粒体的一种标志酶。

种类

琥珀酸脱氢酶有两种,一种是以 泛醌 作为受体的,另一种是作用于所有受体。

琥珀酸 脱氢酶(泛 )

EC编号:1.3.5.1

通用名:琥珀酸脱氢酶(泛醌)

英文:Succinate dehydrogenase(ubiquinone)

催化 反应: 琥珀酸 +泛醌= 反丁烯二酸 + 泛醇 (具备双向催化的功能)

系统名称:琥珀酸:泛醌氧化还原酶

CAS号:9028-11-9

注释:是含铁-硫中心的黄素蛋白。存在于 线粒体 中。

琥珀酸 脱氢酶

EC编号:1.3.99.1

通用名:琥珀酸脱氢酶

英文:Succinate dehydrogenase

催化反应: 琥珀酸 +受体=富马酸+被还原的受体

系统名称:琥珀酸:(受体)氧化还原酶

CAS号:9002-02-2

注释:是含铁-硫中心的黄素蛋白

作用

琥珀酸脱氢酶是连接 氧化磷酸化 与电子传递的枢纽之一,可为 真核生物 线粒体和多种 原核生物 需氧和产能的呼吸链提供电子,其活性一般可作为评价三羧酸循环运行程度的指标。该酶以 FAD 作为其脱下电子的受体,而不是NAD+。琥珀酸脱氢酶与FAD的关系是以 共价键 相互连接,因此它是酶和辅基的关系。很特别,因为一般FAD与酶以非共价键形式结合。尽管 琥珀酸 脱氢酶的作用是专一的,但 丙二酸 (与底物结构上很相似)可以与该酶结合,但酶不能 催化 其脱氢,因此丙二酸是琥珀酸的强 抑制剂 。琥珀酸脱氢酶催化琥珀酸的脱氢具有严格的立体专一性。

琥珀酸脱氢酶与 柠檬酸 循环中的其它酶不同,是唯一嵌入到 线粒体 内膜的酶,是线粒体内膜的一个重要部分,其它酶大多存在于线粒体的基质。

琥珀酸脱氢酶 线粒体 三羧酸循环

琥珀酸脱氢酶(Succinate dehydrogenase,简称SDH), 黄素酶 类,是线粒体内膜的结合酶,属膜结合酶,是连接 氧化磷酸化 与电子传递的枢纽之一,可为 真核生物 线粒体和多种 原核生物 需氧和产能的呼吸链提供电子,为线粒体的一种标志酶。作为参与三羧酸循环的关键酶,琥珀酸脱氢酶是反映线粒体功能的标志酶(markerenzyme)之一,其活性一般可作为评价三羧酸循环运行程度的指标,对于评价精子线粒体功能、研究致 奶牛 缺乏症病理过程等具有重要意义。

提取

琥珀酸脱氢酶的提取与生理意义

琥珀酸脱氢酶存在于所有有氧呼吸 细胞 ,和 线粒体 膜牢固结合,是三羧酸循环中唯一与内膜结合的酶,是脱氢酶中最重要的酶。迄今为止,已从多种 原核生物 和 真核生物 组织中分离纯化出这种酶,为该酶的酶学研究奠定了基础。作为膜内酶,琥珀酸脱氢酶与具有脂双层结构的线粒体膜结合得比较紧密,很难溶解下来,而且其一旦离开膜后,暴露在空气中会很快失活,因此其提纯难度很大。1950年我国著名生物化学家 王应睐 、 邹承鲁 、汪静英等开展对膜蛋白琥珀酸脱氢酶的研究,经过反复实验最后以 正丁醇 抽提法成功地把琥珀酸脱氢酶从鼠肝组织 线粒体 膜上溶解下来,得到了高纯度的水溶性琥珀酸脱氢酶,其活力比同期国外报道者高出1倍以上,从而奠定了我国在琥珀酸脱氢酶研究领域的领先地位。其后,Davis等(1971、1977)使用 NaClO4 从牛心线粒体溶解下此酶;TsukahoHattori和Tadashi Asahi (1982)选用离子型 去垢剂 脱氧胆酸钠 从 番薯 根线粒体提取SDH;Suraveratum等(2000)对恶性疟原虫的琥珀酸脱氢酶进行了纯化;夏玉凤等(2000)以玉米黄化苗为 生物材料 ,通过差速离心获得 线粒体 ,使用超声波将其破碎,用2% 曲拉通X-100 溶膜,超速离心, 硫酸铵 沉淀,DEAE-C32层析纯化琥珀酸脱氢酶; 辛明秀 等(2004)用常规酶学方法从嗜冷酵母(Y18)中分离纯化出有催化活性的琥珀酸脱氢酶。

琥珀酸 脱氢酶是直接连在电子传递链上的,氢受体是 FAD 而不是NAD+,它使琥珀酸氧化为 反丁烯二酸 过程中所产生的 FADH2 与酶结合,将来自FADH2的两个电子直接传递给酶的Fe3+。现有研究表明,琥珀酸脱氢酶由α、β两个亚基组成,α亚基相对分子质量为70.0×103,含有FAD和两个铁硫簇;β亚基相对分子质量为27.0×103,含有一个铁硫簇。

测定

琥珀酸脱氢酶活力测定方法目前主要有五种。

硫酸甲 吩 ( 经前紧张症 )反应法

琥珀酸 脱氢酶能通过一系列人工电子受体,如与PMS(吩嗪二甲酯 硫酸盐 ), DCPIP (2,6- 2,6-二氯靛酚 )等发生反应 催化 琥珀酸的氧化,而借助这些中间产物的颜色变化,通过分光光度计检测即可加以定量反映,其反应式为:①Succinate+PMS→Fumarate+PMSH2;②PMSH2+DCPIP→PMS+DCPIPH2。DCPIP呈蓝色,标准的 吸收光谱 在600nm处,这种色泽可因其还原而渐次变淡,从而600nm处的光密度的变化与DCPIP含量成正比,测定2.6- DPIP 的还原速度可以推算出SDH的活力。一分子 DCPIP 被还原,即代表一分子 琥珀酸 被氧化。故可测定此反应系统在600nm处的吸收光度变化,来计算SDH的活性。SDH活性计算:(标准-测定)/标准=μ 摩尔 /min/mg。

铁氰化钾 [K3Fe(CN)6]还原法

以铁 化钾[K3Fe(CN)6]和 琥珀酸钠 为底物,使琥珀酸脱氢酶 催化 反应将铁氰化钾还原为 亚铁氰化钾 [K4Fe(CN)6],K4Fe(CN)6再与Fe3+作用生成 普鲁士蓝 ,在700nm波长测定吸光值,以检测普鲁士蓝之生成量,作为琥珀酸脱氢酶的还原力,吸光值愈高表示琥珀酸脱氢酶活力愈强。

TTC (氯化 三苯 四唑 )法

无色TTC(2,3,5-氯化三 苯基 四唑 )作为人造受氢体,它在 细胞 呼吸过程中接受氢,还原成三苯基甲膳(TF)。后者以红色 晶体 的形式存在于细胞内,采用有机溶剂(如 甲苯 、 乙酸 乙醋、 三氯甲烷 、 丙酮 或 乙醇 等)进行 萃取 。萃取液测定485nm吸光度后,以TTC还原量表示脱氢酶活性,根据标准曲线计算TF生成量,进而求出TTC-脱氢酶活性。

MTT法

MTT是一种黄颜色的 染料 。活细胞 线粒体 中琥珀酸脱氢酶能够代谢还原MTT,同时在细胞色素C的作用下生成蓝色(或蓝紫色)不溶于水的甲 (Formazana),经 2-丙醇 作用颗粒溶解显色。在通常情况下,甲臜生成量与活细胞数成正比,因此可根据光密度570nm处OD值推测出活细胞的数目。

NBT( 氯化硝基四氮唑蓝 )法

NBT易溶于水,呈淡黄色,以NBT为受氢体,接受由 琥珀酸 钠盐 被酶作用而脱下的氢,进而形成紫蓝色的沉淀,于反应体系中加入PMS,混匀,37℃保温30min,之后加入TCA终止反应。加异丙醇溶解显色,混匀,即可于548nm测OD值。规定:30min内548nm下OD值为1.0时的酶量为1个活力单位。比活力=活力单位数/毫克蛋白。