木瓜蛋白酶

木瓜蛋白酶（papain）是从未成熟的番木瓜果实乳汁中提取得到的白色至浅棕色粉末或液体，又称木瓜酶，是一种含巯基的肽链内切酶，由单链组成，分子量为23406，含有212个氨基酸残基。空间结构由α-螺旋和β-折叠构成。活性中心至少有三个氨基酸残基，包括Cys25、His159和Asp158；每个木瓜蛋白酶分子由两个组氨酸残基（His-81、His-81）和7个半胱氨酸残基（Cys）组成，其中6个半胱氨酸残基形成了3个二硫键。

木瓜蛋白酶气味有硫化氢臭，可溶于水和丙三醇，有一定的吸湿性。最适作用温度为65℃，最适pH范围是5～7。具有较高的热稳定性和耐热性， pH适用范围广且底物专一性低。能水解肽键、酯[zhǐ]键或酰胺键。

木瓜蛋白酶广泛应用于食品、医学、啤酒等领域。因为有抗菌、抗炎、利胆、止痛、助消化等药理作用，所以临床上可用作清创剂、助消化剂、抗炎剂，血型鉴别等。食品上则用于肉类嫩化、饲料加工、啤酒澄清、糕点松化。并且有美白、防晒、护肤和洁白牙齿的功效。还可用于纺织业的羊毛上色、蚕丝脱胶、皮革软化、羊毛防皱。在细胞培养、去污方面也有很好的应用前景。

来源

木瓜蛋白酶广泛存在于木瓜茶的根、茎、叶和果实内，未成熟果实的乳汁中含量最高，全世界有30多个国家生产番木瓜，番木瓜原产于美洲热带地区，在中国的广东、海南省、广西、福建和台湾等地均有番木瓜产出。

发现历史

几个世纪前就有酶疗法的存在，那时南美洲的美洲原住民会用青木瓜的叶子促进消化和康复，墨西哥印第安人长期以来用巴婆树和番木瓜树上的叶子包裹肉进行煮制使肉质变嫩。后来明确主要是得益于木瓜蛋白酶的功效，但当时人们对酶的作用认识还不够深入。

十九世纪七十年代，Wurtz和Bouchut发现木瓜蛋白酶能有效清除白喉的假膜，对结核性溃疡和红斑狼疮也有治疗效果。 1902年L.B.Mendel提出木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶和菠萝蛋白酶可治疗疾病的观点。

美国科学家Wallerstein于1911年从木瓜粉中提取出了木瓜蛋白酶，发现这种酶能除去啤酒中的蛋白质浑浊物。 1913至1919年期间，Kirkheim和Wago观察到注射胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、淀粉酶或胰酶制剂后发生的不良反应与蛋白胨休克症状类似，意识到这些酶有毒性反应，逐渐避免用粗制酶治病，开始转向提纯酶的研究。

1937年Balls和Lineweaver从新鲜木瓜汁中用分级盐析法提取出木瓜蛋白酶结晶。

1940年，Glasser首次报道了用木瓜蛋白酶进行酶清创的方法。木瓜蛋白酶作为酶性清创制剂已经有数十年的使用历史，但因严重的不良反应已经被美国食品药品监督管理局（ FDA ）停止应用。 1958年，Porter等人将免疫球蛋白分子用木瓜蛋白酶水解成抗原结合片段（即Fab）和可结晶片段（即Fc）。

1969年的时候，Husain和Towe报告了该酶的氨基酸排列顺序。 1970年完成了木瓜蛋白酶的序列测定，1971年使用分辨率为0.28nm的X 晶体衍射法测定了其三级结构。

国际上在20世纪80年代曾经采用向肉畜的静脉注射木瓜蛋白酶或菠萝蛋白酶的做法来改善畜肉的嫩度。

药理作用

主要有辅助抗菌、抗炎、利胆、止痛、助消化等药理作用。

消炎止痛

木瓜蛋白酶只作用于坏死组织，分解炎症部位的纤维蛋白或脓液中的黏蛋白，可清洁创面，促进脓液排出，助长新生肉芽，并消肿抗炎，促进药物渗透和创口的愈合。临床上用于治疗水肿、炎症以及驱虫（线虫）。用作清创剂被英国药典和美国药典所收录，与胰蛋白酶、胶原酶联用作为抗炎剂使用。

抗血栓

木瓜蛋白酶能将纤维蛋白溶酶原激活成为纤维蛋白溶酶，，促进纤维蛋白溶解，有间接溶栓作用，还可抑制血小板 FIB-R的活化，进而抑制血小板聚集。

助消化

木瓜 Caspase-3 能促进人体内蛋白酶的活力，延长蛋白酶的作用，促进水解，消化和吸收；能加速体内新陈代谢，缩短乙醇在体内停留时间，降低酒精对机体的损伤，起醒酒、健胃的作用。与乳糖酶、胃蛋白酶、胰脂肪酶联用作为助消化剂。

血型鉴别

木瓜蛋白酶对红细胞膜表面的唾液酸有中和作用，增强IgG抗体的结合能力，与抗痛素联用可避免对正常血型血清学实验的干扰，对Rh血型系统灵敏度高。临床上用于血型鉴别。

作用机理

木瓜蛋白酶有氧化型和还原型两种存在形式，游离的-SH是酶活性所必需的，所以还原型木瓜蛋白酶才有水解蛋白质的能力。

木瓜蛋白酶的催化过程分为化和脱酰化两个步骤。

第一步，底物的肽键、酯键或酰胺键断裂，活性中心的半胱氨酸残基被酰化形成酶复合物：

His-159激活 Cys- 25残基上的疏基（-SH），发生质子转移的Enz-S - 亲核攻击底物RCOOR’（-NH 2 或-NHR’）上的碳基碳原子形成被底物酰化的酶配位化合物 Enz-S-COR。

第二步，酰化的酶配位化合物脱酰化，使半胱氨酸残基上的巯基重新游离出来：

Enz-S-COR中His-159残基攻击H 2 O，发生质子转移，OH - 亲核进攻Enz-S-COR中的碳基碳原子，使Enz-S-COR中S-C键断裂，脱酰化生成产物RCOOH，酶被还原为Enz-SH。

木瓜蛋白酶可分解蛋白质，并水解酰胺键和脂键，但它的反应速率会受到浓度（底物和自身）、抑制剂、激活剂、反应温度和pH值的影响。当半胱氨酸 25与氧化剂、重金属、酸基试剂，过氧化氢等酶抑制剂结合后，酶的活性会受到抑制；还原型谷胱甘肽、还原剂半胱氨酸（或亚硫酸盐）、乙二胺四乙酸二钠、 Cys ，硫化物等激活剂与酶结合后，还原剂可使-SH从-S-S-键再生，EDTA可合金属离子酶，因此酶的活力能得到激活。

应用领域

医学领域

木瓜蛋白酶可将免疫球蛋白水解成两个Fab片段和一个Fc片段，Fab片段可作为抗体药物对某些特定疾病进行治疗，目前已有多种Fab类抗体药物被批准。木瓜蛋白酶可以促进肠胃消化，消炎消肿，驱逐肠道寄生昆虫，与其他要药物配合治疗骨外伤和痣瘘病患，清除伤口创面及皮表上的溃疡且不影响正常组织，促进中药有效成分的煎出，治疗湿疹，还可辅助Rh 血型鉴定。临床上常用于淋巴细胞白血病、青光眼、骨质增生、枪刀伤口愈合、血型鉴别、昆虫叮咬等。

生物实验

细胞培养过程中，可用木瓜蛋白酶分散动物细胞，既能水解肽链和酯键，也能分散成体的骨骼肌。比如木瓜蛋白酶可将大血管和微血管的的血管内皮细胞分离出来，进一步进行血管内皮细胞的培养，优点是收获量大，但对内皮细胞的消化损伤较大。

食品工业

食品工业的加工过程中会产生动物羽毛和血液，鱼类加工会产生鱼排、鱼头等大量蛋白质下脚料，直接加工成饲料后动物难以消化，因为木瓜蛋白酶活力强、耐热性和稳定性好，用于饲料加工可使这些下脚料水解成可溶性的小分子蛋白质及氨基酸，能提高吸收利用度。还可作为添加剂加入畜禽日粮中，帮助饲料消化、提高饲料的效价，减少饲用量，提高禽畜生长率。使奶牛增乳、提高奶质并预防乳腺炎。

木瓜蛋白酶可以分解啤酒酵母菌，得到的酵母提取物可制成香味浓郁的调味品。还可制成保健食品，辅助消化或制成各种营养保健液。用木瓜蛋白酶处理宠物食品可使其黏稠性降低，改变口感和风味，还具有驱虫效果。

酒类

啤酒在低温储存时经常发生混浊，非生物混浊物质有蛋白质、多酚类化合物和少量的糖类。可使用木瓜 Caspase-3 作啤酒澄清剂，加入后酒体有机高分子化合物氮明显降低，中小分子氮含量则相应增加，且随着蛋白酶量的增加总酸会有所升高，泡持力下降，在保证啤酒高清澈度的同时还改善了啤酒的口感及原有多肽和氨基酸的组成和比例，使啤酒品质提高。

肉类

老龄畜肉煮熟后口感粗糙且坚硬，因为肉中含有胶原蛋白蛋白质导致肉质降低。木瓜蛋白酶是嫩肉粉的主要成分之一，能促进肉中结缔组织和胶原蛋白质的降解，破坏肉的结构，使肉的口感变得嫩滑，生成易被人体吸收和利用的小分子物质。，而且木瓜蛋白酶的热稳定性强，在90℃时也不会完全失活，在肉品被蒸煮的期间使用也可充分发挥嫩化作用。

豆类

大豆蛋白在使用过程中存在等电点易沉淀，粘度随浓度增大迅速升高等问题，木瓜蛋白酶通过酶改性改善其物理化学性质，提高大豆蛋白的水解效率。木瓜蛋白酶还有从蛋白质的水解物再合成蛋白质类物质的能力，能改善植物蛋白质的营养价值或功能性质，例如将甲硫氨酸并入到大豆蛋白质中。

糕点松化剂

木瓜蛋白酶能破坏巯基，降低面团筋度，提高饼干的成形性，降低碎饼率增加成品光泽度，并使饼干质地疏松，还可减少油脂和糖的用量。适用于各种风味和档次的饼干、糕点及面包的制造。

美容

木瓜蛋白酶有超氧化物岐化酶（SOD）的特性，有防晒、美白和护肤的功效。木瓜蛋白酶可促进蛋白质合成和新陈代谢，令皮肤细腻光滑，使弹性蛋白和胶原蛋白增多，还可加速色素的分解代谢，有保湿、抗衰老和增白祛斑的作用，与 DL-乳酸一起被制成乳膏和乳液等护肤产品。木瓜蛋白酶还能除去牙齿上蛋白质沉积物用于牙齿美白。

其他工业

纺织工业用菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶和黑曲霉酸性蛋白酶使羊毛在低温下进行染色，上色率和毛纱强度会显著提高。化工行业里，可将木瓜蛋白酶加入洗涤剂中，将某些有机污垢分解为小分子后，增强污渍的水溶性从而去除污垢，木瓜蛋白酶是植物来源的酶，不会造成环境污染，增大了酶在洗衣粉上的应用潜力。工业上还用于蚕丝脱胶，皮革软化、羊毛防皱等。

分子结构

木瓜茶果实中含有4种高度同源的蛋白酶，分别为木瓜蛋白酶（papain）、木瓜凝乳蛋白酶（chymopapain）、木瓜蛋白酶Ω（ papaya proteinaseΩ）日本海棠凝乳蛋白酶M（chymopapain M）。

其中木瓜蛋白酶是含巯基的肽链内切酶，属于蛋白水解酶类化合物。由单肽链组成，含有211个氨基酸残基，包括 19个Tyr残基、5个Trp残基和4个 Phe 残基, 分子量约为23200Da，木瓜蛋白酶的活性中心部位至少含有3个氨基酸残基，包括半胱氨酸 25、His159和Asp158 ，与Asn175残基一同构成了酶的活性部位。有六个半胱氨酸残基形成了三对二硫键，分别为 Cys- 22与Cys-65、Cys-56与Cys-95、Cys-153与Cys-200。

木瓜蛋白酶的空间结构呈椭圆状，由α- 螺旋组成的L-区域和大量反向平行β-折叠片层组成的R-区域组成，又叫C端结构域和N端结构域。活性部位就在两个结构域之间的裂缝中。活性中心的两侧是 Cys 25和His159， Cys- 25位于L-区域起始α-螺旋上，L-区域有3个α-螺旋和5个疏水性氨基酸残基。这些氨基酸残基空间位置比较接近，有利于酶催化功能的发挥。

二硫键的结构决定木瓜 Caspase-3 具有高的热稳定性、酸碱稳定性和去垢剂抗性，有较强的合成能力和蛋白酶水解能力，因此有稳定性好、耐高温、活性强的特点。

理化性质

木瓜蛋白酶是白色至浅棕色粉末或液体，呈粉末状时有一定的吸湿性，有硫化氢臭，可溶于水和 56-81-5 ，在乙醇、三氯甲烷和乙醚等有机溶剂中几乎不溶。水溶液为无色至浅黄色，有时为乳白色。在25℃时，水溶液测定比旋光度 =66.7°（pH5.7）。蛋白质等电点（pI）为9.55。 275～280nm处有紫外吸收峰，木瓜蛋白酶具有较高的热稳定性，耐热性强，最适作用温度为65℃， 90℃时也不会完全失活；在磷化氢 ~9的范围内会稳定存在， pH＜3或pH＞11时则很快失活，在pH5.0的弱酸性条件下最稳定，最适pH范围是5～7，在中性或偏碱性时均起作用。

分离纯化

木瓜蛋白酶最原始的提取方法是烘干法，这种原始的提取方法不利于保持酶活性，制得的酶纯度较低。也曾广泛使用单宁沉淀法，此方法酶活力较高产率却很低，还易对环境造成污染。目前生产中多采用超滤、絮凝、盐析等方法：

盐析法

盐析法中高浓度的中性盐离子的水化能力可夺取酶分子的水化层使木瓜蛋白酶的胶粒失水沉淀。所以可用一定浓度的氯化钠溶液或硫酸铵溶液进行盐析，但得到的酶产品活性较低，因为大量的盐使酶中灰分增加，所以盐析法也是非理想的木瓜蛋白酶提取方法。

絮凝法

絮凝法是在木瓜乳胶水提取液中添加某种化合物，能与木瓜蛋白酶生成难溶性的复合物进而沉淀析出。此方法提取专一性不强，得到的木瓜蛋白酶纯度低而杂质含量较高。

超滤膜分离法

超滤膜分离法是通过控制一定压力和流量将处理后的清液通过中空纤维超滤膜进行超滤，大分子的木瓜蛋白酶在超滤过程中被截留，其他杂质则透过膜，截留率可达93%以上，此方法条件温和，不易破坏生化物质，超滤后的木瓜蛋白酶纯度和活力增加，是一种比较好的分离技术。但超滤过程中膜表面的浓差极化现象会使速率逐渐下降，还有酶在有机溶剂中易变性和有机溶剂残留的问题。

超声波法、亲和膜色谱法、双水相萃取法则是新型的提取技术，超声波的空化效应和微射流效应可提高提取率，但得到的粗酶液含量低需进一步纯化，亲和膜色谱法则比柱亲和色谱更易规模化生产，萃取分离法有收率高、易于连续化操作、无有机溶剂残留和分离过程经济的优点，是较好的木瓜蛋白酶分离提取方法。

所有方法都是根据木瓜蛋白酶的物理化学性质对提取工艺进行优化得来的，通常是盐析、过滤、离心、浓缩、结晶、干燥等各种方法的排列组合，以达到最大限度利用资源实现效益最大化的目的。

固定化酶技术

因为酶具有蛋白质特性，所以稳定性较差，对热不稳定、易被强酸强碱和有机溶剂破坏，单次使用后丧失活性和催化能力，不能重复利用。将酶固定在高分子材料等特定载体上后，稳定性能显著增强、贮藏期也得到延长、便于分离回收、促使生产工艺实现自动化和连续化，降低成本，大大提高酶的利用率并缩短了反应时间。吸附法、包埋法和载体交联法是木瓜蛋白酶的常用固定化方法。可利用的载体有改性后的竹材料、壳聚糖、磁性粒子、尼龙等，固定化的木瓜蛋白酶热稳定性、耐酸碱性等特性和功能都得到了优化和提高，能更好的发挥催化作用。

安全事宜

储存

木瓜蛋白酶的活性中心有一个自由的巯基，易受到分子氧的攻击粘性失活，需密封0～4℃处保存。

毒性

番木瓜蛋白酶是木瓜果实的组分，是无毒的，所以对每日允许摄入量（ ADI ）不作特殊规定，用量以GMP为限（FAO/WHO,2001）。

来源