三羧酸循环

三羧酸循环（tricarboxylic acid cycle，简称TCA循环），又称柠檬酸循环、Krebs循环， 是在有氧条件下 丙酮酸 在 线粒体 中彻底氧化分解、释放能量的代谢途径，发生于线粒体底物中，但也会部分地在线粒体内膜或嵴膜上发生。

三羧酸循环是 英国 生物化学家Hans Krebs于1937年提出的概念。 三羧酸循环从 乙酰辅酶A 和 草酰乙酸 这两种底物开始，经过 柠檬酸 的生成反应、柠檬酸的异构化反应、 异柠檬酸 的 氧化脱羧 反应、 α-酮戊二酸 的氧化脱羧反应、 琥珀酸 的生成反应、 反丁烯二酸 的生成反应、 DL-苹果酸 的生成反应、草酰乙酸的再生反应，重新生成草酰乙酸，完成一个循环。该循环的特点包括碳骨架的变化、水分子的参与、对氧的需求。一分子的乙酰-CoA在被柠檬酸循环代谢后，可产生两分子的CO 2 分子、三分子NADH、一分子FADH 2 ，以及一分子GTP。

三羧酸循环不仅是 糖代谢 的主要途径，也是三大营养物质（ 糖类 、 脂类 和氨基酸）的最终代谢通路，又是糖类、脂类、 氨基酸代谢病 相互联系的枢纽，在动植物和微生物细胞中普遍存在，具有重要的生理意义。

定义

在有氧条件下，糖酵解产物 丙酮酸 经过 氧化脱羧 形成 乙酰辅酶A 。乙酰-CoA通过一个循环被彻底氧化为CO₂和H₂O，同时释放出大量能量。因为这个过程的第一个产物是含有三个羧基的柠檬酸，所以称为三羧酸循环（tricarboxylic acid cycle，简称TCA循环）或柠檬酸循环，也称为Krebs循环。

历史发展

1911~1920年，T.Thunberg发现约40种 有机化合物 能为动物组织所氧化，其中以 琥珀酸 、 反丁烯二酸 、 DL-苹果酸 和 柠檬酸 被氧化最快，他还提出 冰醋 氧化循环机理。1935年，Szent Györgyi发现三 羧酸 循环成员的所有羧酸均能刺激动物组织的呼吸作用，它以氧化葡萄糖等底物为基础。

1937年， 英国 生物化学家Hans Krebs在总结前人工作及他本人利用鸽胸肌进行的一系列实验的基础上提出三羧酸循环，他也因此获得了1953年的 诺贝尔生理学或医学奖 。

丙酮酸的氧化脱羧

大部分生物的糖分解代谢是在有氧条件下进行，糖酵解生成的丙酮酸在有氧条件下的彻底氧化分解。从丙酮酸开始的彻底氧化可分为两个阶段：丙酮酸氧化脱羧生成 乙酰辅酶A 和乙酰-CoA的 乙酰 部分经过三羧酸循环被彻底氧化。

由于生成丙酮酸的糖酵解途径在 细胞质 中进行，而丙酮酸脱氢酶复合体和三 羧酸 循环过程中的反应都位于 线粒体 中，所以细胞质中产生的丙酮酸需要进入线粒体基质。丙酮酸进入线粒体是通过线粒体外膜上的通道和内膜上的丙酮酸易位酶来完成的。

丙酮酸氧化脱羧生成乙酰-CoA

丙酮酸的氧化脱羧是糖酵解产物丙酮酸在有氧条件下，由丙酮酸脱氢酶复合体（pyruvate dehydrogenase complex，PDC） 催化 生成 乙酰辅酶A 的反应。该反应既脱氢又脱羧，故称氧化脱羧。该反应不可逆，它本身不属于糖酵解，也不属于三羧酸循环，却是连接糖酵解与三羧酸循环的中心环节。

催化这一反应的丙酮酸脱氢酶复合体位于线粒体内膜上，是一个结构复杂的多酶复合体，由丙酮酸脱氢酶（E1）、二氢硫辛酰转乙酰酶（E2）和二氢硫辛酰脱氢酶（E3）3种酶组成。此外，在多酶复合体中还包含有硫胺素焦磷酸（ tpp ）、 α-硫辛酸 、CoA-SH、FAD、NAD⁺等辅助因子。其中TPP是El的辅基，硫辛酸是E2的辅基，FAD是E3的辅基。

丙酮酸 氧化脱羧 的过程可以分为以下几个步骤：首先由丙酮酸脱氢酶（E1） 催化 丙酮酸与TPP连接并脱羧，生成 羟乙基 -TPP，而后羟乙基氧化为 乙酰 并转移给二氢硫辛酰转乙酰酶（E2）的 硫辛酰胺 。TPP-E1回复原来的状态。

接下来由E2催化乙酰基转移至CoA的 巯基 ，生成 乙酰辅酶A ，此时酶分子中的硫辛酰胺是还原态。在二氢硫辛酰脱氢酶（E3）的催化下，将二氢硫辛酰胺的氢传递给FAD生成FADH₂，同时分子本身被氧化，重新形成 氧化数 的二氢硫辛酰转乙酰酶。FADH₂再将氢传递至NAD⁺，生成NADH，E3再生为氧化态。整个过程中，第一步脱羧反应是不可逆的。

丙酮酸氧化脱羧反应的调节

丙酮酸的氧化脱羧反应是决定丙酮酸命运的关键步骤。由丙酮酸氧化脱羧生成的乙酰-CoA进入三羧酸循环继续氧化，而NADH+H + 则进入电子传递链生成ATP。 催化 该反应的丙酮酸脱氢酶复合体受到能量水平与代谢物水平的调节，其调节机制包括别构调节和共价调节。

产物的别构调节

丙酮酸氧化脱羧的产物NADH和 乙酰辅酶A 能够抑制丙酮酸脱氢酶的活性，其中乙酰-CoA抑制二氢硫辛酰转乙酰酶，NADH抑制二氢硫辛酰脱氢酶。此外， 丙酮酸 脱氢酶复合体的活性受 细胞 能荷的调控。当细胞能量消耗增加时，AMP、CoA-SH和NAD⁺能别构激活该酶的活性；当细胞能量供应充足时，ATP抑制丙酮酸 氧化脱羧 的进行。

磷酸化共价调节

丙酮酸脱氢酶分子的特定 丝氨酸 残基受可逆的磷酸化共价调节。可逆的磷酸化反应由专一的蛋白激酶和磷酸酶 催化 ，能够使丙酮酸脱氢酶的一个亚基磷酸化而失活。酶的去磷酸化形式为活性状态，而磷酸化形式为非活性状态。ATP、NADH和 乙酰辅酶A 能够增强磷酸化反应，抑制酶的活性；ADP、NAD⁺和CoA-SH能够抑制磷酸化反应，增强酶的活性。

循环过程

三羧酸循环的总化学反应式：乙酰-CoA+3NAD + +FAD+GDP+Pi+2H 2 O→2CO 2 +3NADH+FADH 2 +GTP+3H + +CoA-SH

三羧酸循环包括 柠檬酸 的生成反应、柠檬酸的异构化反应、 异柠檬酸 的 氧化脱羧 反应、 α-酮戊二酸 的氧化脱羧反应、 琥珀酸 的生成反应、 反丁烯二酸 的生成反应、 DL-苹果酸 的生成反应、 草酰乙酸 的再生反应等主要步骤。

柠檬酸的生成反应

在柠檬酸合酶（citrate synthase）的 催化 下， 乙酰辅酶A 与草酰乙酸缩合生成柠檬酰-CoA，而后高能 硫代酸酯 水解 形成1分子柠檬酸并释放CoA-SH。这是三羧酸循环途径的第1步反应，也是限速反应。反应释放大量的自由能，反应是不可逆的。

ATP、NADH和 琥珀酰辅酶A 是 柠檬酸 合酶的别构抑制剂；ADP是该酶的别构 激活剂 。此外，底物 乙酰-CoA 和 草酰乙酸 的浓度对柠檬酸的合成速度有重要影响。柠檬酸合酶是三羧酸循环中的第一个调节酶。

柠檬酸的异构化反应

在 顺乌头酸酶 （aconitase）的 催化 下，柠檬酸先脱水生成顺乌头酸，然后再加水生成 异柠檬酸 。这是一步可逆的异构化反应。

这个反应的底物柠檬酸是一个具有前手性的对称分子。所谓前手性是指一个非手性分子经 取代反应 后失去对称性转变为手性分子的特性。前手性分子上存在立体异位面。例如， 柠檬酸 分子中心的碳原子形成四面体结构，当顺乌头酸酶与柠檬酸分子不同的侧面结合时就会有 立体结构 上的差异。同位素标记结果显示，此步异构化反应 羟基 只能连接在来自 草酰乙酸 的碳原子上。这说明 顺乌头酸酶 对柠檬酸分子的结合是有立体选择性的，异构化生成 异柠檬酸 的反应是不对称的。

异柠檬酸的氧化脱羧反应

这是三羧酸循环的第1次 氧化还原反应 。在 异柠檬酸脱氢酶 （isocitrate dehydrogenase）的 催化 下，异柠檬酸被氧化脱氢，生成草酰琥珀酸中间产物。草酰琥珀酸是一个不稳定的β- 酮酸 ，迅速脱羧生成 α-酮戊二酸 。反应释放大量自由能，因此是不可逆的。异柠檬酸脱氢酶是三羧酸循环中的第二个调节酶。

α-酮戊二酸的氧化脱羧反应

这是三羧酸循环中第2个氧化脱羧反应，在α-酮戊二酸脱氢酶复合体（α-ketoglutarate dehydrogenase complex）的催化下，α-酮戊二酸氧化脱羧并结合CoA-SH生成 琥珀酰辅酶A 、1分子NADH+H⁺和1分子CO₂.这一步反应释放出大量能量，是不可逆反应。

α-酮戊二酸 脱氢酶复合体与 丙酮酸 脱氢酶复合体的结构和 催化 机制相似，由α-酮戊二酸脱氢酶、二氢硫辛酰转 琥珀酰 酶和二氢硫辛酰脱氢酶3种酶组成，也需要 tpp 、 α-硫辛酸 、CoA-SH、FAD、NAD⁺等辅助因子的参与，并同样受产物NADH、琥珀酰-CoA及ATP、GTP的 反馈抑制 。但与丙酮酸脱氢酶复合体不同的是α-酮戊二酸脱氢酶复合体不受磷酸化调节。

琥珀酸的生成反应

这是三羧酸循环中唯一的通过底物水平磷酸化直接产生高能磷酸化合物的反应。在 琥珀酰辅酶A 合成酶（succinyl-CoA synthetase） 催化 下，高能化合物琥珀酰-CoA的高能 硫代酸酯 水解 释放的能量使GDP磷酸化生成GTP，同时生成琥珀酸。GTP很容易将磷酸基团转移给ADP形成ATP。动物中，有两种琥珀酰-CoA合成酶的同工酶，分别对ADP或GDP专一，生成ATP或GDP；但在植物中 琥珀 草酰琥珀酸是一个不稳定的β- 酮酸 ，迅速脱羧生成 α-酮戊二酸 。反应释放大量自由能，因此是不可逆的。 异柠檬酸脱氢酶 是三羧酸循环中的第二个调节酶。

延胡索酸的生成反应

该反应是三羧酸循环中的第3个 氧化还原反应 。在 琥珀酸脱氢酶 （succinate dehydrogenase）的 催化 下，琥珀酸被氧化脱氢生成延胡索酸（反丁烯二酸），酶的辅基FAD是氢受体，反应生成1分子FADH₂。琥珀酸的结构类似物 丙二酸 等是琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂。

琥珀酸脱氢酶与其辅基以共价方式结合，FAD 杂环化合物 上的 甲基 与酶分子的一个 组氨酸的生物合成 杂环上的 氮 形成 共价键 。这种连接方式不同于绝大多数酶与FAD辅基的紧密而非共价的结合。琥珀酸脱氢酶是三羧酸循环中唯一与线粒体内膜结合的酶（其他的酶都分布于线粒体基质中）。因此，在参与三羧酸循环的同时，它也参与电子传递过程。由 琥珀酸脱氢酶 催化 的反应脱下的氢和电子能够直接进入线粒体内膜的电子传递链。

苹果酸的生成反应

延胡索酸酶（fumarase）可催化延胡索酸发生水合反应生成苹果酸。由于该酶具有立体专一性，此反应仅生成L-苹果酸。该反应具有可逆性。

草酰乙酸的再生反应

该反应是三羧酸循环中的第4个 氧化还原反应 ，也是最后一步反应。在 苹果酸脱氢酶 （malate dehydrogenase）的催化下，苹果酸氧化脱氢生成草酰乙酸，NAD⁺是氢受体，至此，草酰乙酸得以再生，又可接受进入循环的 乙酰辅酶A 分子，进行下一轮三羧酸循环反应。

能量产生

自乙酰-CoA进入三羧酸循环开始，在第3、4、6、8步共4个氧化还原反应中各脱下1对氢原子，其中3对氢原子交给NAD⁺，生成3分子NADH+H + ，另1对氢原子交给FAD生成FADH₂。NADH+H⁺和FADH₂在电子传递链中被氧化，电子经过电子传递体传递给O₂并与ATP的生成偶联。在 线粒体 中每个NADH+H + 产生2.5个ATP，每个FADH₂产生1.5个ATP，经计算共可转化为9分子ATP。另外，在 琥珀酰辅酶A 生成 琥珀酸 时，伴随着底物水平磷酸化生成1分子GTP（植物中为ATP）。因此，1分子 乙酰辅酶A 通过三羧酸循环被氧化共可产生10分子ATP。

葡萄糖彻底氧化分解需要经过糖酵解途径、 丙酮酸 氧化脱氢脱羧和柠檬酸循环途径，最终生成产物水和 二氧化碳 。下面我们来计算一下葡萄糖彻底氧化分解产生的ATP的数量。

首先，1分子葡萄糖经糖酵解途径分解成2分子丙酮酸净生成2分子ATP和2分子NADH。 原核生物 中2分子NADH经电子传递链产生5分子ATP，因此折合7分子ATP。 真核生物 糖酵解途径产生的NADH可分别经磷酸 丙三醇 系统或 DL-苹果酸 天门冬氨酸 穿梭系统，在 线粒体 中形成FADH₂或NADH，因此2分子NADH可产生5分子或7分子ATP。

接下来，2分子 丙酮酸 转变成2分子 乙酰辅酶A 时生成2分子NADH，可以产生5分子ATP。

1分子乙酰-CoA通过三羧酸循环被氧化可产生10分子ATP，2分子乙酰-CoA能够产生20分子ATP。

综合起来，1分子葡萄糖经过糖酵解途径、丙酮酸氧化脱氢脱羧和三羧酸循环途径，最终可以产生32分子ATP（ 原核生物 ），30分子或32分子ATP（ 真核生物 ）。

调控功能

研究一个代谢途径的调控首先要了解 催化 其 速率控制步骤 的酶，以及这些酶在体内的底物的浓度和调节方式。然而，这种研究对于三羧酸循环来说却相当困难。这主要是因为三羧酸循环的很多中间产物既存在于 线粒体 中，也存在于 细胞质 中。这就使得对酶催化反应底物或产物的浓度难以确定。因此，在研究过程中我们首先假定这些物质在线粒体内外处于平衡状态，然后以 细胞 中的总浓度来推测线粒体中的浓度。

从△G⁰可以判断有三个酶是调节三羧酸循环途径的关键酶，即柠檬酸合酶、 异柠檬酸脱氢酶 和 α-酮戊二酸 脱氢酶复合体。

三羧酸循环调控的驱动力是细胞对能量的需求，因此调节过程必然与细胞中氧的消耗、NADH的氧化以及ATP的生成密切相关。通过前面章节的学习我们已经知道，糖酵解和糖异生途径主要的调节方式是对关键酶的别构调节、共价修饰调节及底物的影响。对于三羧酸循环途径来说，其调控主要是3种简单的机制：①底物效应，②产物抑制，③其他代谢物的竞争性 反馈抑制 。

柠檬酸 合酶的活性受其底物 草酰乙酸 和 乙酰辅酶A 浓度的调节。草酰乙酸浓度下降会抑制柠檬酸的合成。同样，能够与乙酰-CoA竞争的其他脂酰-CoA也能够竞争性地减少柠檬酸的合成。此外，当ATP水平高时，与酶结合的乙酰-CoA较少，导致合成的柠檬酸减少。

异柠檬酸脱氢酶 的活性能够被ATP、 琥珀酰辅酶A 和NADH抑制；ADP能够激活该酶的活性。这是由于ADP是该酶的变构 激活剂 ，能增大此酶对底物的亲和力。

α-酮戊二酸 脱氢酶复合体受ATP及其所 催化 的反应产物琥珀酰-CoA、NADH的抑制。在α-酮戊二酸脱氢酶复合体中，二氢硫辛酰转 琥珀酰 酶是关键酶，它能够对进入循环的α-酮戊二酸进行调控从而调节三羧酸循环的正常运行。琥珀酰-CoA是该酶的强烈抑制剂，ATP和NADH抑制该酶的活性。

主要特点

碳骨架的变化

乙酰辅酶A 进入三 羧酸 循环后，产生了六碳的三羧酸（ 柠檬酸 ）。释放1分子CO₂后，形成五碳的 二羧酸 （ α-酮戊二酸 ），α-酮戊二酸释放1分子CO₂，形成了四碳的二羧酸（ 琥珀酰辅酶A ）。之后都是二羧酸的反应。三羧酸循环的整个过程是两个碳原子被氧化成CO₂离开循环。

水分子的参与

在整个循环过程中消耗了2分子水，1分子用于柠檬酸的合成，另1分子用于 反丁烯二酸 的水合作用，形成L- DL-苹果酸 。水的加入相当于向中间产物上加入了氧原子，促进了还原性碳原子的氧化。另外，在琥珀酰-CoA合成酶催化的反应中，GDP磷酸化所释放的水也用于高能 硫代酸酯 的 水解 ，二者在数量上相互抵消。

对氧的需求

分子氧并不直接参与三羧酸循环，但三羧酸循环只能在有氧条件下才能进行，因为只有当电子传递给分子氧时，NADH和FADH₂才能再生为NAD⁺和FAD；如果没有氧，NAD⁺和FAD不能再生，三羧酸循环就不能继续进行，因此，三羧酸循环是严格需氧的。

生物学意义

1.三羧酸循环是生物界中的动物、植物及微生物中都普遍存在的代谢途径，是机体将糖或其他物质氧化而获得能量的最有效方式。在 糖代谢 中，糖经此途径氧化产生的能量最多。

2.三羧酸循环的中间产物如草酰 冰醋 、 α-酮戊二酸 、 丙酮酸 、 乙酰辅酶A 等是合成糖、氨基酸、脂肪等 生物分子 的原料。此外该循环是糖、 蛋白质 和脂肪彻底氧化分解的共同途径，是联系3大类物质代谢的枢纽。蛋白质 水解 的产物如 谷氨酸 、 天门冬氨酸 、 丙氨酸 等脱氨或转氨后的碳架要通过三羧酸循环才能被彻底氧化；脂肪分解产生 丙三醇 和 脂肪酸 ，脂肪酸经β-氧化产生乙酰-CoA，甘油和乙酰-CoA彻底氧化都需要经过三羧酸循环。

3. 柠檬酸 性质很活泼，在 糖代谢 的调节中很重要，别构抑制6- 磷酸果糖激酶 2使果糖-2,6-二磷酸减少，抑制糖的分解;柠檬酸还可促进 乙酰辅酶A 羧化酶，促进脂肪酸的合成。 琥珀酰辅酶A 与 甘氨酸 一起作为合,成血红素的原料;乙酰CoA又是合成胆固醇的原料。三羧循环在提供生物合成的 前体 中起重要作用。

回补反应

三羧酸循环从 草酰乙酸 与乙酰-CoA的 羟醛缩合 开始，到草酰乙酸的再生结束，其过程中的中间产物可以成为很多 生物分子 合成的 前体 。例如， α-酮戊二酸 和草酰乙酸分别是 谷氨酸 和 天门冬氨酸 合成的碳架； 琥珀酰-CoA 是叶绿素和血红素中 卟啉 环合成的前体； 柠檬酸 转运至 细胞质 后裂解成 乙酰辅酶A 可用于 脂肪酸 合成。上述过程都消耗三羧酸循环的中间产物，最终导致中间产物浓度下降，从而影响三羧酸循环的进行。因此，必须从其他代谢途径补充一些中间产物才能使保证三羧酸循环的正常进行。这种补充称为回补反应（anaplerotic reaction）。回补反应主要有以下几种途径。

丙酮酸羧化生成草酰乙酸

在哺乳动物的肝脏和肾脏中，丙酮酸羧化成草酰乙酸是最重要的回补反应。在 丙酮酸羧化酶 （pyruvate carboxylase）的 催化 下，丙酮酸在 线粒体 中生成草酰乙酸，该反应的辅基是 生物素 。

丙酮酸羧化酶是一个调节酶，它被高浓度的 乙酰辅酶A 激活。它催化的反应是动物中最重要的回补反应。其催化机制在第三节糖异生中已有介绍。

磷酸烯醇式丙酮酸羧化生成草酰乙酸

在磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEP carboxylase）的作用下，磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）生成 草酰乙酸 。该反应在 细胞质 中进行，生成的草酰乙酸需转变成 DL-苹果酸 后经穿梭进入线粒体，然后再脱氢生成草酰乙酸。这是糖异生作用途径中草酰乙酸转变为磷酸烯醇式丙酮酸的逆过程。

苹果酸脱氢生成草酰乙酸

在 苹果酸酶 （malic enzyme）的 催化 下， 丙酮酸 羧化生成苹果酸，再在 苹果酸脱氢酶 的作用下脱氢生成草酰乙酸。其中苹果酸脱氢酶以NAD⁺作为辅酶。

氨基酸形成草酰乙酸

天门冬氨酸 和 α-酮戊二酸 经转氨作用，可形成草酰乙酸和 谷氨酸 。此外， 异亮氨酸 、 缬氨酸 、 Thr 和 甲硫氨酸 也可形成 琥珀酰辅酶A 来补充三羧酸循环的中间产物。